52/70, với liều 100TCID50/50ộl/con.
Tại thời gian 15 ngày sau khi tiêm virus Gumboro lần cuối, chúng tôi tiến hành lấy ngẫu nhiên ở mỗi lô gà ựã ựược gây tối miễn dịch 10 quả trứng ựể sản xuất chế phẩm. Trứng sau khi ựược thu về, ựánh dấu riêng từng lô và thu riêng lòng ựỏ của từng lô. Như vậy, ở 3 lô gà gây tối miễn dịch theo 3 quy trình như trên, chúng tôi thu ựược 3 lô chế phẩm khác nhau: lô I, lô II, lô III.
Quá trình thu trứng ựể sản xuất chế phẩm như sau: Trứng ựược rửa sạch bằng dung dịch thuốc sát trùng và làm khô ở nhiệt ựộ thường. Sát trùng cồn 700. Dùng kéo hoặc dao mổ vô trùng làm vỡ vỏ trứng. Lọai bỏ hết lòng trắng trứng. Thu hoạch lòng ựỏ vào một bình 20 lắt vô trùng. Cho từ từ dung môi vào với tỷ lệ thắch hợp và khuấy ựều ựể thành một huyễn dịch ựồng nhất. Lọai bỏ mỡ và các thành phần khác bằng phương pháp ly tâm. Thu hoạch phần nước có chứa kháng thể. Pha loãng lòng ựỏ trứng bằng dung môi thắch hợp. Kiểm tra hiệu giá kháng thể trong lòng ựỏ trứng bằng phương pháp trung hòa trên tế bào xơ phôi gà. Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể trong chế phẩm ựược thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Kết quả xác ựịnh quy trình tối miễn dịch cho gà Quy trình tối miễn dịch Hàm lượng kháng thể
(VN) Lô thắ Lô thắ nghiệm Vacxin (1ml/con) Virus cường ựộc CVL 52/70 VN kiểm tra
sau 15 ngày đánh giá
1 2 lần cách nhau 1 tuần 1 tuần 3 lần cách nhau 1 tuần 1/1280 đạt 2 3 lần cách nhau 1 tuần 3 lần cách nhau 1 tuần 1/2560 đạt 3 4 lần cách nhau 1 tuần 3 lần cách nhau 1 tuần 1/2560 đạt
Như vậy, theo kết quả kiểm tra cho thấy cả 3 lô kháng thể Gum thắ nghiệm ựều cho kết quả chuẩn ựộ hiệu giá kháng thể ≥ 1/640. Tham chiếu theo tiêu chuẩn của OIE, chúng tôi kết luận các lô kháng thể Gum ựều ựạt tiêu chuẩn. Vấn ựề ựặt ra là sự sai khác về hàm lượng kháng thể thu ựược từ lòng ựỏ trứng của các quy trình gây tối miễn dịch cho gà mẹ không rõ ràng giữa quy trình 2 và quy trình 3 (ựều có hiệu giá kháng thể là 1/2560). Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể cho thấy ở quy trình 1 gây tối miễn dịch cho gà mẹ, hiệu giá kháng thể trong lòng ựỏ chỉ ựạt 1/1280, mặc dù thấp hơn so với hai quy trình sau, nhưng vẫn ựạt tiêu chuẩn kiểm tra. Từ kết quả bảng 3.1, chúng tôi ựề xuất sử dụng quy trình 2 gây tối miễn dịch cho gà ựẻ (sử dụng 3 lần tiêm vacxin và 3 lần công cường ựộc) ựể làm quy trình tiêu chuẩn cho sản xuất chế phẩm kháng thể chống bệnh Gumboro trong lòng ựỏ trứng.
3.1.2. Kết quả xác ựịnh thời gian thu hoạch trứng sản xuất chế phẩm sau khi gây tối miễn dịch trên ựàn gà. khi gây tối miễn dịch trên ựàn gà.
Sau khi công cường ựộc, trong cơ thể gà mẹ vừa có kháng thể chống bệnh Gumboro, vừa có một lượng virus cường ựộc nhất ựịnh. để ựảm bảo an toàn khi thu trứng chế kháng thể. Thời ựiểm thu trứng cần ựược xác ựịnh vào thời ựiểm trong máu gà mẹ có hàm lượng kháng thể cao và không còn virus cường ựộc.
để xác ựịnh thời gian virus Gumboro cường ựộc ựược hoàn toàn bài trừ ở cơ thể gà mẹ, chúng tôi tiến hành lấy huyết thanh của gà mẹ tại thời ựiểm 5 ngày và 15 ngày sau tiêm phòng và gây nhiễm cho tế bào xơ phôi gà. Trường hợp xuất hiện bệnh tắch tế bào ựược coi là yếu tố chỉ ựiểm cho sự có mặt của virus trong huyết thanh gà và ngược lại. Kết quả xét nghiệm ựược trình bày ở bảng 3.2.
Kết quả bảng 3.2 cho thấy tại 5 ngày sau khi công cường ựộc, hàm lượng kháng thể của gà mẹ có thể ựược ựẩy lên rất cao, dao ựộng từ 1/2560 ựến 1/5120. Tuy nhiên tại thời ựiểm này, khi kiểm tra bằng gây nhiễm tế bào
thì thấy vẫn có bệnh tắch tế bào. Do ựó, virus vẫn còn tồn tại trong huyết thanh gà mẹ.
Sau 15 ngày công cường ựộc, lượng kháng thể trong gà mẹ dao ựộng từ 1/1280 ựến 1/2560. Lúc này, khi làm thắ nghiệm gây nhiễm virus cho tế bào, kết quả ựều thu ựược là âm tắnh.
Như vậy, từ ngày 15 trở ựi, virus ựã không còn ở trong máu của gà mẹ, và vào lúc này có thể bắt ựầu thu trứng ựể sản xuất kháng thể.
Bảng 3.2. Kết quả xác ựịnh khoảng thời gian bắt ựầu thu trứng ựể sản xuất kháng thể
Kết quả 5 ngày sau công cường ựộc
Kết quả 15 ngày sau công cường ựộc Lô thắ nghiệm Số mẫu kiểm tra VN Virus VN Virus 1 5 1/2560 + 1/1280 - 2 5 1/5120 + 1/2560 - 3 5 1/5120 + 1/2560 -
Khi lượng kháng thể trong huyết thanh gà mẹ ựã ựạt cao ở 15 Ờ 21 ngày sau khi gây tối miễn dịch thì sẽ giảm dần. Vì vậy lượng kháng thể ựược truyền vào lòng ựỏ trứng cũng giảm dần, ựến một thời ựiểm nào ựó lòng ựỏ trứng thu ựược dùng ựể sản xuất chế phẩm sẽ không còn khả năng bảo hộ cao với bệnh ựược nữa. Vì vậy, việc xác ựịnh ựược thời gian thu trứng ựể sản xuất chế phẩm sẽ góp phần làm nâng cao chất lượng hiệu lực của chế phẩm, xác ựịnh ựược thời gian gây tối miễn dịch cho ựợt sau, tránh lãng phắ, giảm giá thành sản phẩm.
để xác ựịnh khoảng thời gian thu hoạch trứng sản xuất chế phẩm sau khi gây tối miễn dịch trên ựàn gà, chúng tôi dùng phản ứng trung hoà trên gà. Phương pháp tiến hành ựã ựược giới thiệu ở phần phương pháp nghiên cứu.
Các lô chế phẩm ựể làm thắ nghiệm ựược sản xuất từ trứng thu ựược sau khi gây tối miễn dịch ở các thời ựiểm 15 ngày, 45 ngày, 60 ngày. Mỗi lô chế phẩm ựược trộn với virus gumboro cường ựộc với tỷ lệ 1,5 ml chế phẩm và 100TCID50/50ộl. Hỗn dịch ựược tiêm cho 90 gà thắ nghiệm.
Ở 10 gà ựối chứng, không tiêm chế phẩm, chỉ tiêm virus Gumboro cường ựộc 100TCID50/50ộl.Toàn bộ gà ựược nuôi dưỡng, chăm sóc chu ựáo, theo dõi số gà có hoặc không có biểu hiện triệu chứng bệnh Gumboro sau 10 ngày. Kết quả ựược chúng tôi trình bày ở bảng 3.3.
Ở lô chế phẩm sản xuất từ trứng thu sau khi gây tối miễn dịch 15 ngày, sau 10 ngày theo dõi trong 30 gà thắ nghiệm thì có 1 con gà biểu hiện bệnh Gumboro, 29 con gà không biểu hiện . Tỷ lệ biểu hiện bệnh là 3,33%. Tương tự ở lô chế phẩm sản xuất từ trứng thu sau khi gây tối miễn dịch 45 ngày, sau 10 ngày theo dõi trong 30 gà thắ nghiệm thì cũng chỉ có 1 con gà biểu hiện triệu chứng bệnh Gumboro, chiếm tỷ lệ 3,33%.
Ở lô chế phẩm sản xuất từ trứng thu sau khi gây tối miễn dịch 60 ngày, sau 10 ngày theo dõi trong 30 gà thắ nghiệm thì có 11 con gà biểu hiện triệu chứng bệnh Gumboro, tỷ lệ là 36,67%.
Ở lô ựối chứng gà biểu hiện các triệu chứng, bệnh tắch nặng nề với tỷ lệ là 100%.
Từ kết quả trên chúng tôi nhận thấy thời gian thu hoạch trứng thắch hợp nhất ựể sản xuất chế phẩm cho tỉ lệ bảo hộ cao là từ 15 Ờ 45 ngày sau khi gây tối miễn dịch cho gà ựẻ.
3.1.3. Quy trình sản xuất chế phẩm kháng thể ựặc hiệu chống Gumboro
Từ những kết qủa trên chúng tôi xác ựịnh ựược quy trình sản xuất chế phẩm kháng thể ựặc hiệu chống Gumboro sơ ựồ 1. Theo như sơ ựồ 1, quy trình sản xuất kháng thể ựặc hiệu chống Gumboro gồm các bước cơ bản:
- Gây tối miễn dịch cho gà mẹ theo quy trình số 2 (3 lần tiêm vacxin Gumboro vô hoạt nhũ dầu và 3 lần tiêm virus Gumboro cường ựộc)
- Thu hoạch kháng thể lòng ựỏ trứng bằng phương pháp ly tâm (ảnh 3.1) - Kiểm tra hiệu giá kháng thể của chế phẩm bằng phương pháp trung hòa trên tế bào sơ phôi gà một lớp (ảnh 3.2).
- Pha loãng chế phẩm ựể ựạt tiêu chuẩn về hàm lượng kháng thể - Kiểm nghiệm chế phẩm (vô trùng, an toàn, hiệu lực)
- Ra chai, dán nhãn, bảo quản chế phẩm.
Hình 3.1: Ly tâm ựể thu hoạch kháng thể lòng ựỏ trứng
Hình 3.2: Phản ứng trung hòa trên tế bào