Chương 2 NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.3. Phương pháp làm phản ứng trung hoà trên tế bào xơ phôi gà một lớp
* Chuẩn bị tế bào xơ phôi gà 1 lớp CEF trên các ựĩa nhựa 96 giếng. Nuôi cấy tế bào xơ phôi gà 1 lớp: Trứng gà có phôi ựược ấp 10 ổ 1 ngày tuổi ựược thu hoạch thai. Sử dụng panh, kéo vô trùng cắt bỏ ựầu thai, chân, cánh, loại bỏ hết nội tạng, rửa sạch bằng dung dịch PBS. Cắt nhỏ thai và tách tế bào bằng dung dịch Trypsin 0,25% trên máy khuấy từ trong vòng 30 phút, gạn phần tế bào ựã tách, giữ ở 40C ựể dừng hoạt ựộng của Trypsin. Phần còn lại tiếp tục tách cho ựến hết tế bào. Sau khi tách, ly tâm loại bỏ Trypsin, rửa tê bào 3 lần bằng PBS, pha loãng, ựếm số, chia tế bào thu ựược vào môi trường nuôi cấy tế bào, chia ra các chai nuôi và nuôi cấy ở nhiệt ựộ 350C. Hàng ngày kiểm tra sự phát triển của tế bào bằng kắnh hiển vi. Khi tế bào mọc trên 80% diện tắch bề mặt nuôi cấy thì ựược sử dụng làm phản ứng trung hoà.
* Chuẩn bị kháng thể pha loãng: Sử dụng một ựĩa nhựa 96 giếng ựể pha loãng kháng thể. Cho 50ộl môi trường vào tất cả các giếng của ựĩa nhựa 96 giếng, trừ hàng ựầu tiên. Cho 90ộl môi trường MEM và 10ộl mẫu Kháng thể Gum vào giếng ựầu tiên (hàng ựầu). Mẫu ựược pha loãng 1/10. Sử dụng 1 hàng của ựĩa nhựa chuẩn ựộ ựể kiểm tra ựối chứng huyết thanh, ựối chứng tế bào và kiểm tra lại nồng ựộ virus. Trộn ựều mẫu ở hàng ựầu tiên, sau ựó
chuyển 50ộl sang hàng kế tiếp, cứ thế tiếp tục cho ựến hàng cuối cùng thì bỏ (pha loãng theo cơ số 2).
* Chuẩn bị kháng nguyên cố ựịnh: Chuẩn bị virus Gumboro dùng trong
phản ứng là 100TCID50/50ộl. Cho 50ộl virus Gumboro cường ựộc chủng CVL 52/70vào tất cả các giếng (trừ hàng ựối chứng). để ựĩa nhựa 96 giếng ở nhiệt ựộ phòng trong 30 phút ựể kháng thể trung hoà kháng nguyên.
* Gây nhiễm cho giếng tế bào và ựọc kết quả:
Sử dụng hỗn dịch kháng nguyên Ờ kháng thể ựể gây nhiễm cho tế bào xơ phôi gà. Xác ựịnh bệnh tắch tế bào bằng kắnh hiển vi. Hiệu giá kháng thể của mẫu ựược xác ựịnh ở nồng ựộ pha loãng cao nhất của mẫu kiểm tra mà ở ựó có thể trung hòa virus Gumboro. (Hay nói cách khác hiệu giá kháng thể của mẫu ựược xác ựịnh ở nồng ựộ pha loãng cao nhất của mẫu kiểm tra mà ở ựó không có CPE)