CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1.1. Xác định hàm lượng fucoidan
Định lượng hàm lượng fucoidan Hàm lượng Fucoidan được xác định theo phương phỏp acid cysteine-sulfuric (Dische và Shettles). Đầu tiờn, cho vào ống 500 àL dung dịch mẫu được làm lạnh trong nước đá, sau đó cho thêm dung dịch acid sulfuric vào ống
32
nghiệm mẫu. Dung dịch acid sulfuric được chuẩn bị trước bằng cách pha acid sulfuric đậm với nước cất tỷ lệ là 1:6 (v/v). Tiếp theo tiến hành nâng nhiệt hỗn hợp lên 25oC và giữ trong 5 phút, sau đó ống hỗn hợp được đặt vào nước sôi trong 5 phút. Ống hỗn hợp được làm lạnh và trộn đều với 0,1ml dung dịch cysteine hydrochloride (dung dịch cysteine hydrochloride được điều chế bằng cách sử dụng cysteine hydrochloride hòa tan trong nước cất). Cuối cùng, độ hấp thụ của hỗn hợp được đo ở bước sóng 396 nm và 427 nm. Nước cất được sử dụng làm mẫu trắng. Giá trị hấp thụ được tính bằng phương trình sau: Aht = (A396 nm - A427 nm). Sử dụng chất chuẩn là L-fucose thương mại (Sigma).[25]
2.2.1.2. Xác định hàm lượng Phlorotannin
Định lượng phlorotannin/polyphenol theo phương pháp của Swanson cùng cộng sự. Nguyên tắc của phương pháp dựa trên phản ứng màu với thuốc thử Folin - Ciocalteu với phloroglucinol là chất chuẩn. Lấy 300 àl dịch mẫu bổ sung 1 ml thuốc thử Folin- Ciocalteu 10%, giữ 5 phút. Sau đó thêm vào 2 ml Na2CO3 10%, trộn đều, giữ 90 phút trong bóng tối và đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 750 nm trên máy UV-Vis. Hàm lượng phlorotannin/polyphenol được tính theo đương lượng phlorolglucinol.[26]
2.2.1.3. Phương pháp xác định độ ẩm
Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy khô đến khối lượng không đổi (phụ lục).
2.2.1.4. Phương pháp phân tích vi sinh
- Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí: theo tiêu chuẩn ISO 6887-1 (9/1999).
- Xác định Escherichia coli: theo tiêu chuẩn ISO/TS 16649-3:2005 (TCVN 7924- 3:2008).
- Xác định Salmonella spp: theo TCVN 4829:2005
- Xác định Coliforms: theo tiêu chuẩn ISO 4831:2006 (TCVN 4882:2007) - Xác định tổng số bào tử nấm men - nấm mốc theo TCVN 8275-1:2010.
2.2.1.5. Phương pháp định lượng một số thành phần khác - Xác định thủy ngân (Hg) theo TCVN 7604: 2007
- Xác định Cadmi (Cd) theo TCVN 7603: 2007 - Xác định chì (Pb) theo TCVN 7602: 2007
33
- Xác định Arsen (As) theo TCVN 7601: 2007 - Xác định thiếc (Sn) theo TCVN 7788: 2007 - Xác định Methyl thủy ngân theo AOAC 988.11 2.2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm
Hình 2.2 Sơ đồ chiết hợp chất từ rong mơ
Dịch chiết Rửa sạch
Loại muối
Sấy khô
Nghiền
Bảo quản
Chiết
Lọc
Rong tươi nguyên liệu
Sấy phun
Phối trộn Bột sấy
Trà Đánh giá hàm lượng
chất tan trong dịch chiết: fucoidan, phlorotannin
34
❖ Thuyết minh quy trình
• Rong tươi nguyên liệu: Rong mơ Sargassum nguyên liệu được thu mẫu tại vùng biển Ninh Thuận. Rong mơ sau khi thu mẫu, được rửa sạch bằng nước biển sau đó vận chuyển về phòng thí nghiệm để làm nguyên liệu cho quá trình nghiên cứu.
• Rửa sạch, loại muối
Mục đích: loại bỏ bớt tạp chất và muối, bám dính trên rong nguyên liệu. Tiến hành rửa rong bằng nước sạch, sau đó ngâm trong nước lạnh ở mức nhiệt độ 8-10oC (sử dụng đá làm lạnh) trong 24h, mỗi 8 tiếng thay nước một lần, giữ nhiệt độ ổn định để tránh làm thối rong. Sau đó vớt rong ra để rao nước. Thao tác rửa phải nhanh và sạch, đồng thới tránh làm dập rong khi rửa, gây tổn thất chất tan theo nước.
• Sấy khô
Rong được sấy khô bằng kỹ thuật sấy lạnh kết hợp với bức xạ hồng ngoại ở nhiệt độ sấy 47oC, tốc độ gió 2m/s trong thời gian khoảng 3,5 giờ đến độ ẩm < 18% thì thu rong khô và đóng gói bằng bao bì PE, bảo quản ở nhiệt độ thường để dùng trong suốt quá trình nghiên cứu.
Hình 2.3 Rong tươi sau khi sấy khô
• Nghiền rong: Rong sau khi được sấy khô được đem đi nghiền nhỏ bằng máy nghiền, chọn mắt nghiền ỉ = 1mm.
35
Hình 2.4 Rong đã nghiền thành dạng bột
• Bảo quản: Rong sau khi được nghiền nhỏ thì được đóng gói trong bao bì PE để tránh hút ẩm, bảo quản ở nơi thoáng mát, ở nhiệt độ thường
• Chiết: tiến hành chiết bằng phương pháp khuếch tán làm giàu, tiến hành thí nghiệm các ảnh hưởng đến khả năng tách chiết các chất từ trong rong.
• 5 nhóm, thời gian 2h/nhóm.
• Lọc: lọc dung dịch thu được đến trong để thu được dịch lọc.
• Sấy phun: tiến hành sấy phun dịch lọc thu được sau khi trộn với chất mang là maltose dextrin với tỷ lệ 11% (w/v), nhiệt độ buồng sấy 140-150oC, tốc độ đĩa phun 15000-16000rpm, áp suất phun 2atm.
• Phối trộn: tiến hành phối trộn với cỏ ngọt, đường.
Xác định thông số ảnh hưởng đến quá trình chiết: dung môi, nhiệt độ, số lần - Mục đích: nhằm lựa chọn thông số phù hợp nhất để đạt được hàm lượng các loại chất tan mục đích cao nhất.
- Tiến hành: tiến hành sử dụng phương pháp chiết khuếch tán làm giàu với 5 nhóm cho 8 mẫu rong khô đã nghiền 50g (10g/nhóm), 4 mẫu sử dụng dung môi là cồn 90o, 4 mẫu sử dụng dung môi là nước cất, thời gian chiết 2h/nhóm, nhiệt độ chiết lần lượt là 40oC, 50oC, 60oC, 70oC cho mỗi mẫu sử dụng một loại dung môi, một mẫu chiết 3 lần.
Sau đó mẫu đã dùng ở trên được tiếp tục chiết với dung môi đổi ngược: Các mẫu đã chiết 3 lần bằng cồn thì được chiết tiếp 3 lần nữa bằng nước cất và ngược lại. Dịch lọc thu được tách biệt theo từng lần và từng mẫu sau đó được tiến hành đi phân tích các thông số theo phương pháp ở trên. Dựa vào kết quả để lựa chọn thông số thích hợp nhất.
36
❖ Sơ đồ bố trí thí nghiệm: