Lectin có bản chất là protein hay glycoprotein dễ tan trong nước nên việc chiết xuất lectin ra khỏi các mô động vật, thực vật hay vi sinh vật có thể thực hiện dễ dàng bằng cách dùng các dung dịch muối loãng hoặc các dung dịch đệm chứa muối làm dung môi chiết xuất. Tùy theo tính chất của mỗi loại lectin người ta có thể sử dụng các dung môi chiết xuất khác nhau như dung dịch nước muối sinh lý NaCl 0,9%; CaCl2
0,1M; dung dịch đệm PBS, đệm Tris-HCl…
❖ Kỹ thuật kết tủa bằng muối trung tính
Phần lớn lectin bị kết tủa bởi một số muối trung tính ở nồng độ cao và có thể được hòa tan trở lại. Các muối thường dùng để kết tủa protein là muối cation hóa trị 1, anion đa hóa trị như: (NH4)2SO4, Na2O4, Na2SO4….Các protein khác nhau được kết tủa ở những nồng độ muối trung tính khác nhau. Người ta sử dụng phương pháp này trong các quy trình chiết xuất lectin để cô đặc dung dịch protein cần tách.
❖ Kết tủa phân đoạn bằng dung môi
Một số dung môi hữu cơ có thể dễ hòa tan trong nước như axetone, polyetylenglycol, ethanol…làm giảm độ hòa tan trong nước của protein đến mức chúng có thể bị kết tủa nhanh chóng. Nhược điểm chủ yếu của phương pháp này là rất dễ gây biến tính protein, vì vậy việc sử dụng dung môi để kết tủa lectin cần phải được tiến hành ở nhiệt độ thấp.
22
❖ Thẩm tích
Phương pháp thẩm tích được tiến hành dựa trên nguyên lý sử dụng màng bán thấm với đặc tính cho qua những phần tử nhỏ hòa tan và giữ lại những phần tử lớn.
Trong phương pháp này, màng bán thấm ở dạng túi chứa chất cần thẩm tích đặt trong môi trường có pH nhất định, các phân tử nhỏ trong túi sẽ khuếch tán ra môi trường ngoài nhờ tác động của máy khuấy từ. Thẩm tích thường dùng để loại muối và những chất phân tử nhỏ không phải protein ra khỏi dung dịch chứa lectin cần thẩm tích.
1.5.2 Các kỹ thuật tinh chế lectin
❖ Sắc ký trao đổi ion
Lectin có bản chất protein nên phân tử của nó mang điện tích. Tùy thuộc vào pH của môi trường mà lectin mang điện tích dương hoặc âm. Lợi dụng tính chất này người ta đã sử dụng cột sắc ký trao đổi ion để tinh chế lectin. Các chất nhựa gắn các nhóm chứa ion tích điện dương như DEAE-sephadex, DEAE-xenluloza, DEAE- trisacryl…được sử dụng làm chất trao đổi anion. Các chất nhựa gắn các nhóm chức ion tích điện âm như CM-sephadex, CM-xenluloza, CM-trisacryl…được sử dụng làm chất trao đổi cation.
Người ta có thể sử dụng hai loại chất trao đổi ion ở trên để tinh chế lectin dựa vào bản chất ion hóa và khả năng trao đổi ion của phân tử lectin trong những điều kiện môi trường pH nhất định.
❖ Sắc ký lọc gel
Đây là phương pháp tách lectin ra khỏi hỗn hợp protein dựa vào kích thước phân tử. Chất giá thường được sử dụng là Sephadex. Mỗi hạt Sephadex có bản chất là polysaccharide chứa nhiều liên kết ngang tạo thành hệ thống lỗ lưới xốp. Có nhiều loại Sephadex, trong đó mỗi loại có mức độ liên kết khác nhau tạo nên kích thước của lỗ xốp khác nhau. Chính mức độ liên kết này quyết định khả năng phân tách các chất có kích thước phân tử khác nhau. Để tinh chết lectin, người ta thường dùng loại Sephadex G-75 và Sephadex G-100.
Phương pháp sắc ký lọc gel còn được dùng để xác định khối lượng phân tử của chất cần tách.
23
❖ Sắc ký ái lực
Nguyên tắc của phương pháp sắc ký ái lực là dựa trên ái lực kết hợp đặc hiệu của lectin với một phân tử khác gọi là chất kết hợp (ligand) được gắn vào một chất giá tạo nên pha tĩnh của cột sắc ký. Chất giá được sử dụng nhiều nhất là một số loại gel:
Sephadex, Sepharose, Sephacryl, Ultrogel….Quá trình thực hiện sắc ký ái lực được tiến hành qua 3 giai đoạn: giai đoạn 1 là tạo cột ái lực với lectin, giai đoạn 2 là gắn hay hấp phụ lectin vào cột ái lực và giai đoạn 3 là phản hấp phụ lectin khỏi cột ái lực.
Quá trình thực hiện sắc ký phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố: dung dịch giải hấp phụ, tốc độ dòng chảy.
24