CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.3. Bố trí thí nghiệm thu nhận lectin từ rong biển
❖ Sơ đồ quy trình nghiên cứu tổng quát
❖
❖
❖
Hình 2.2: Sơ đồ quy trình nghiên cứu tổng quát thu nhận lectin từ rong biển
Rong B.
gelatinus
Xay nhuyễn Chiết Lọc, ly tâm
Dịch chiết Kết tủa Ly tâm
Tủa Thẩm tích Sắc kí trao đổi ion
DEAE-sephadex
Lectin
Bã
Dịch
Sắc ký lọc gel Sepharyl S-200
Xác định:
-Ảnh hưởng nhiệt độ -Ảnh hưởng của pH Khảo sát:
-Dung môi chiết
-Tỉ lệ nguyên liệu-dung môi chiết (w/v)
-Thời gian chiết (giờ)
Khảo sát:
-Nồng độ EtOH (%)
30
❖ Giải thích quy trình
Mẫu rong B. gelatinus sau khi thu về được rửa sạch, xay rong thành bột mịn bằng cối xay inox có bổ sung Nitơ lỏng, rong sau khi xay được bảo quản trong tủ đông -20oC cho đến khi xử dụng.
Cân 2g mẫu. Tiến hành chiết lectin theo các thông số : dung môi chiết, nhiệt độ chiết, tỉ lệ nguyên liệu:dung môi chiết, thời gian chiết thích hợp. Sau đó lọc, li tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút để loại bỏ bã, thu dịch chiết.
Tiếp đến, lectin trong dịch chiết được tủa bằng Ethanol ở 4oC trong 6 giờ. Tiến hành li tâm ở tốc độ 6000 vòng/phút trong 30 phút để thu phần tủa. Phần tủa được hòa tan trong đệm PBS (0,02M, NaCl 0,15M, pH 7,5). Sau đó dịch tủa được thẩm tích trong dung dịch đệm PB (0,02M, pH 7,5) ở 4oC nhằm loại bỏ muối và các phân tử nhỏ mà không phải là lectin ra khỏi dung dịch. Dịch tủa sau thẩm tích được li tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 30 phút, thu phần dịch trong, đây là là chế phẩm lectin.
Lectin thô được tinh chế bằng phương pháp sắc kí trao đổi ion DEAE-sephadex và sắc kí lọc gel Sepharyl S-200, ta thu được dịch lectin.
2.3.4. Phương pháp xác định các điều kiện tối ưu để chiết lectin từ rong B.
gelatinus
Phương pháp khảo sát: khi khảo sát một yếu tố nào đó trong quá trình tách chiết như nồng độ dung môi, nhiệt độ chiết, thời gian chiết… thì các yếu tố còn lại được cố định. Yếu tố nào khảo sát xong thì sẽ được cố định ở giá trị thích hợp để khảo sát đến các yếu tố khác.
31
❖ Khảo sát dung môi chiết Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 2.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát dung môi chiết Giải thích quy trình
Cân 2g mẫu, tiến hành chiết lectin từ rong B. gelatinus bằng 5 dung môi: nước cất, đệm PBS 0,05M 0,85% NaCl, ethanol 10%, ethanol 20%, ethanol 30% với tỷ lệ nguyên liệu:dung môi (w/v) 1:6, nhiệt độ chiết 4oC và thời gian chiết 4 giờ. Sau đó, ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch chiết.
Xác định hàm lượng protein, HĐTS và HĐR của từng dịch chiết. So sánh, chọn ra loại dung môi chiết thích hợp.
Rong B.
gelatinus
Xay nhuyễn
Dịch chiết Lọc, li tâm
Chiết
Nước cất EtOH 10% EtOH 20% EtOH 30%
Đánh giá và chọn dung môi thích hợp
-Tỉ lệ nguyên liệu:
dung môi (w/v): 1:6 -Thời gian chiết: 4 giờ
-Nhiệt độ chiết: 4oC
Xác định:
-Hoạt độ tổng số -Hoạt độ riêng Bã
PBS
32
❖ Khảo sát tỷ lệ dung môi chiết Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 2.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát tỉ lệ nguyên liệu : dung môi chiết (w/v) Giải thích quy trình
Cân 2g mẫu, tiến hành chiết lectin từ rong B. gelatinus bằng dung môi thích hợp đã khảo sát với các tỷ lệ nguyên liệu:dung môi (w/v) 1:4, 1:6, 1:8, 1:10, ở nhiệt độ 4oC và thời gian chiết là 4 giờ. Sau đó, ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch chiết.
Xác định hàm lượng protein, hoạt độ tổng số (HĐTS) và hoạt độ riêng (HĐR) của từng DC. So sánh, chọn ra tỷ lệ nguyên liệu : dung môi chiết (w/v) thích hợp.
Rong B.
gelatinus
Xay nhuyễn
Dịch chiết Lọc, li tâm
Chiết
1:4 (w/v) 1:6 (w/v) 1:8 (w/v) 1:10 (w/v)
Đánh giá và chọn tỉ lệ nguyên liệu:dung môi (w/v) thích hợp
-Dung môi chiết -Thời gian chiết: 4 giờ
-Nhiệt độ chiết: 4oC
Xác định:
-Hoạt độ tổng số -Hoạt độ riêng Bã
33
❖ Khảo sát thời gian chiết Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 2.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát tỉ thời gian chiết (giờ) Giải thích quy trình
Cân 2g mẫu, tiến hành chiết lectin từ rong B. gelatinus với các khoảng thời gian khác nhau: 2, 4, 6, 8 (giờ), với dung môi, tỷ lệ nguyên liệu : dung môi (w/v) thích hợp và nhiệt độ chiết 4oC. Sau đó, ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút, thu DC.
Xác định hàm lượng protein, HĐTS và HĐR của từng DC. So sánh, chọn ra thời gian chiết thích hợp.
Rong B.
gelatinus
Xay nhuyễn
Dịch chiết Lọc, li tâm
Chiết
2 (giờ) 4 (giờ) 6 (giờ) 8 (giờ)
Đánh giá và chọn thời gian chiết (giờ) thích hợp
-Dung môi chiết -Tỉ lệ nguyên liệu:
dung môi (w/v) -Nhiệt độ chiết: 4oC
Xác định:
-Hoạt độ tổng số -Hoạt độ riêng Bã
34
2.3.5 Khảo sát các tác nhân tủa Ethanol và nồng độ (%) thích hợp để thu chế phẩm lectin kỹ thuật
Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 2.6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ EtOH (%)
Rong B.
gelatinus
Xay nhuyễn Chiết Lọc, ly tâm
Dịch chiết Kết tủa
Ly tâm Tủa Thẩm tích Bã
-Dung môi chiết: EtOH 20%
-Tỉ lệ nguyên liệu-dung môi chiết (w/v): 1:6 -Thời gian chiết (giờ): 4 -Nhiệt độ chiết: 4oC
-Tác nhân EtOH (%) -Thời gian tủa: 4 giờ -Nhiệt độ tủa: 4oC
Xác định:
-Hoạt độ tổng số -Hoạt độ riêng
60% 70% 80%
Lectin thô
Đánh giá và chọn nồng độ Ethanol thích hợp Bã
35
Giải thích quy trình
Sau khi xác định các điều kiện thích hợp để chiết lectin từ rong đỏ B.
gelatinus. Tiến hành khảo sát khả năng kết tủa lectin trong dịch chiết bằng các nồng độ Ethanol khác nhau: 60, 70, 80%. Thời gian tủa 6 giờ và nhiệt độ tủa là 4oC
Chế phẩm lectin được thu nhận bằng cách li tâm dịch tủa với tốc độ 6000 vòng/phút trong 30 phút. Sau đó, phần tủa được hòa tan trong đệm PBS (0,02M, NaCl 0,15M, pH 7,5) trước khi thẩm tích bằng dung dịch đệm PB (0,02M, pH 7,5) ở 4oC.
Dịch tủa sau thẩm tích được li tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 30 phút, thu phần dịch trong. Đây chính là chế phẩm lectin.
Tiến hành xác định HĐTS, HĐR và hiệu suất thu hồi của chế phẩm lectin, từ đó chọn ra nồng độ tủa EtOH (%) thích hợp.
2.3.6 Tinh sạch bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion DEAE-Sepharose.
Nhựa DEAE sepharose là nhựa trao đổi anion yếu. Hỗn hợp mẫu qua cột sắc kí chứa nhiều loại protein với khả năng tích điện tích âm khác nhau, do đó khả năng liên kết với nhựa cũng sẽ khác nhau. Trong quá trình rửa giải, khi thay đổi nồng độ muối, những protein nào liên kết yếu với cột sẽ bị đẩy ra trước, còn những protein liên kết chặt hơn sẽ bị đẩy ra ở nồng độ muối cao hơn
Dịch lectin thô được tinh chế bằng sắc kí trao đổi ion DEAE-sepharose với các thông số được thiết lập như sau:
- Gel: DEAE-Sepharose - Kích thước cột: 1,6 x 20 cm
- Đệm: PB (0,02M; pH 7,5) (de gas) ; PBS (0,02M; NaCl 0,2M; pH 7,5) (de gas) - Thể tích mẫu: 6ml
- Tốc độ dòng: 10 ml/phút
- Thể tích mỗi phân đoạn: 10 ml/phân đoạn - Số lượng phân đoạn: 36 phân đoạn
- Tổng thể tích rửa giải: 360 ml
Xác định hoạt tính NKHC của các phân đoạn, từ đó thu nhận các phân đoạn có hoạt tính và tiến hành cô đặc nồng độ bằng màng siêu lọc kích cỡ 10 kDa
Vẽ đồ thị biễu diễn sự tương quan giá trị A 280 nm, hoạt độ NKHC và thứ tự các phân đoạn.
36
2.3.7. Tinh sạch lectin bằng phương pháp sắc ký lọc gel Sephacryl S-200
Hệ thống sắc kí lọc gel gồm pha cố định là một loại gel có cấu tạo dạng mạng lưới (rây) và lỗ rây. Kích thước của các lỗ rây này là khác nhau tùy theo loại gel sử dụng. Còn pha động là đệm hay một loại dung môi thích hợp. Các chất khi đi qua hệ thống lọc gel sẽ được phân tách theo nguyên tắc: các phân tử có kích thước to hơn kích thước lỗ rây, không thể chui lọt vào bên trong lỗ rỗng sẽ len qua phần kẽ hở giữa các hạt gel và nhanh chóng theo dòng chảy của pha động đi ra khỏi cột. Còn các phân tử có kích thước phân tử nhỏ hơn kích thước lỗ rây sẽ toàn phần hoặc bán toàn phần lọt vào lỗ rỗng, cuối cùng theo dòng chảy ra khỏi cột.
Sephacryl S-200 có khả năng phân tách những protein có kích thước 5x103- 2,5x105 Da.
Dịch lectin sau khi khi tinh sạch bằng sắc kí trao đổi ion được thẩm tích trong đệm PB (0,02M pH 7,5) và tiến hành tinh sạch bằng kĩ thuật sắc khí lọc gel với các thông số được thiết lập như sau:
- Gel: Sephacryl S-200
- Kích thước cột: 1,6 x 60 cm.
- Đệm: PBS (0,02M, NaCl 0,15M, pH 7) (đã loại khí) - Thể tích mẫu: 0,5 ml
- Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút
- Thể tích mỗi phân đoạn: 2,5 ml/phân đoạn - Số lượng phân đoạn: 40 phân đoạn
Xác định hoạt tính NKHC của các phân đoạn, từ đó thu nhận các phân đoạn có hoạt tính và tiến hành cô đặc nồng độ bằng màng siêu lọc kích cỡ 10 kDa.
Vẽ đồ thị biễu diễn sự tương quan giá trị A 280 nm, họat độ NKHC và thứ tự các phân đoạn.
37
2.3.8. Phương pháp xác định ảnh hưởng của các tác nhân: nhiệt độ, pH đến hoạt tính NKHC của lectin từ rong đỏ B. gelatinus.
❖ Khảo sát nhiệt độ hoạt động thích hợp
Cho 0,5 ml mẫu dung dịch lectin vào ống nghiệm, ủ ở các nhiệt độ khác nhau:
40, 50, 60, 70, 80, 90, 100oC trong 30 phút, sau đó làm lạnh nhanh. Mẫu được đem xác định lại hoạt tính NKHC và so sánh với hoạt tính NKHC của mẫu ban đầu để xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính NKHC của lectin từ rong đỏ B. gelatinus.
❖ Khảo sát pH hoạt động thích hợp
Cho 0,5 ml mẫu dung dịch lectin thẩm tích trong các mức pH khác nhau: 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ở nhiệt độ 4oC. Sau đó, thẩm tích ngược lại với dung dịch NaCl 0,15M trong 4 giờ để loại các pH dư trong mẫu. Phần dịch trong túi thẩm tách được li tâm với tốc độ cao 10000 vòng/phút trong 5 phút. Phần dịch trong được xác định hoạt tính NKHC và so sánh với hoạt tính NKHC của mẫu ban đầu để xác định ảnh hưởng của pH đến hoạt tính NKHC của lectin từ rong đỏ B. gelatinus.