Kết quả tổng hợp quá trình tinh sạch lectin từ rong đỏ B. gelatinus

3.2. KẾT QUẢ TINH SẠCH LECTIN TỪ RONG ĐỎ B. GELATINUS

3.2.4. Kết quả tổng hợp quá trình tinh sạch lectin từ rong đỏ B. gelatinus

Tiến hành tinh sạch lectin từ rong đỏ B. gelatinus bằng các thông số thích hợp đã được khảo sát. Qua từng bước tinh sạch, tiến hành xác định hàm lượng protein, hoạt độ NKHC, hiệu suất và độ tinh sạch được thể hiện ở bảng 3.3.

Bảng 3.3: Kết quả tinh sạch lectin từ rong đỏ B. gelatinus

Qua các bước tinh sạch, chúng ta nhận thấy, HĐTS cũng như protein tổng số của chế phẩm thu được giảm đi đáng kể từ 36800 HU và 705,38 mg xuống còn 1240 HU và 2,16 mg tương ứng. Điều này có thể giải thích là do sự tổn thất và biến tính bất thuận nghịch của một số phân tử protein trong suốt quá trình tinh sạch.

Kết quả từ bảng 3.3 cũng cho thấy, khi tủa protein bằng tác nhân cồn, HĐR của protein lectin từ rong B. gelatinus tăng lên đáng kể. Sau khi tủa, HĐR của CPKT là 110,82 HU/mg trong khi DC thô chỉ có HĐR là 52,17 HU/mg vì quá trình tủa đã loại bớt được một số tạp chất.

Sau đó, qua quá trính sắc kí trao đổi ion và sắc kí lọc gel, ta sẽ thu được những phân tử protein có hoạt độ NKHC và loại bỏ được các protein không thể hiện hoạt độ NKHC nên HĐR của lectin sau khi tinh sạch và hệ số tinh sạch ở giai đoạn này đều cao nhất (HĐR 574,3 HU/mg; hệ số tinh sạch 11,01 lần).

Kết quả này cũng được minh chứng rõ hơn, khi nồng độ protein nhỏ nhất có thể tạo nên 1 đơn vị hoạt độ NKHC cũng giảm dần qua các bước tinh sạch: MAC ở dịch thô là 0,0192 mg/HU; sau khi tủa giảm còn 0,009 mg/HU và sau khi sắc ký lọc gel giá trị này chỉ còn 0,0017 mg/HU.

Protein tổng (mg)

MAC (mg/HU)

HĐTS (HU)

HĐR (HU/mg)

Độ tinh sạch

Hiệu suất (%) Dịch chiết thô 705.38 0.0192 36800 52.17 1 100

Dịch sau kết

tủa 103.95 0.0090 11520 110.82 2.12 31.30

Dịch sau sắc kí trao đổi ion

DEAE- sepharose

5.06 0.0027 1872 370.0 7.09 5.09

Dịch sau sắc kí lọc gel Sephacryl S-

200

2.16 0.0017 1240 574.3 11.01 3.37

45

Từ những kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi đưa ra quy trình công nghệ thu nhận lectin từ rong B. gelatinus cụ thể như sau:

Hình 3.7: Sơ đồ quy trình công nghệ thu lectin từ rong B. gelatinus

❖ Giải thích quy trình

Mẫu rong biển Betaphycus gelatinus được rửa sạch, xay nhuyễn thành bột mịn bằng cối xay inox có bổ sung Nitơ lỏng.

Mẫu rong được chiết bằng dung môi ethanol 20% với tỷ lệ nguyên liệu : dung môi (w/v) 1:6 ở nhiệt độ 4oC trong 4 giờ. Thu hồi dịch chiết bằng bộ lọc thô để loại cặn lẫn trong DC, sau đó li tâm 6000 vòng/phút trong 15 phút, thu phần dịch trong chuẩn bị cho quá trình tinh sạch.

Dịch chiết thô lectin được tủa bằng tác nhân ethanol 70% với nhiệt độ tủa 4oC và để trong khoảng thời gian 4 giờ. Sau đó, tiến hành ly tâm lạnh ở 4oC với tốc độ 6000 vòng/phút trong 30 phút để thu phần kết tủa. Hòa tủa bằng dung dịch đệm PBS

-Dung môi chiết Ethanol 20%

-Tỉ lệ nguyên liệu-dung môi chiết 1:6 w/v -Thời gian chiết: 4 giờ - Nhiệt độ chiết: 4oC

Rong B.

gelatinus

Xay nhuyễn Chiết lectin Kết tủa lectin Sắc kí trao đổi ion

DEAE-sephadex Sắc ký lọc gel Sepharyl S-200

Lectin

- Nồng độ EtOH 70%

- Thời gian tủa: 4 giờ - Nhiệt độ tủa: 4oC

46

(0,02M; NaCl 0,15M; pH 7,5) và thẩm tích trong dung dịch PB (0,02M; pH 7,5) để loại bỏ muối.

Dịch tủa sau thẩm tích được li tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 30 phút, thu phần dịch trong. Dịch trong được bơm vào cột trao đổi ion DEAE-Sepharose, tiến hành chạy sắc kí trao đổi ion với tốc độ dòng 10 ml/phút. Sử dụng pha động là dung dịch đệm PB (0,02M; pH 7,5) (de gas) để rửa giải các protein và màu không liên kết ra khỏi cột, đến khi đo A 280nm bằng 0. Sau đó, dùng pha động là dung dịch đệm PBS (0,02M; NaCl 0,5M; pH 7,5) (de gas) để rửa giải các protein liên kết với cột. Tiến hành đo A 280nm và xác định hoạt tính NKHC của từng phân đoạn. Thu lại các phân đoạn có hoạt tính NKHC.

Các phân đoạn có hoạt tính NKHC được cô đặc bằng phương pháp siêu lọc và thẩm tích trong đệm PBS (0,02M; NaCl 0,15M, pH 7) ở 4oC và để qua đêm, nhằm cân bằng nồng độ muối và pH. Dịch sau thẩm tích được li tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 30 phút, thu phần dịch trong.

Dịch trong được bơm vào cột gel Sephacryl S-200, tiến hành chạy sắc kí lọc gel với tốc độ 0,8 ml/phút, sử dụng pha động là dung dịch đệm PBS (0,02M; NaCl 0,15M;

pH 7) (de gas) để rửa giải cột. Mỗi phân đoạn thu 2,5 ml. Tiến hành đo A 280nm và xác định hoạt tính NKHC của từng phân đoạn. Thu lại các phân đoạn có hoạt tính NKHC.

Các phân đoạn có hoạt tính NKHC được cô đặc bằng phương pháp siêu lọc.

Chúng ta đã tinh sạch và thu được dịch lectin.

47