CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3 Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu là nghiên cứu tiến cứu, mô tả, theo dõi dọc.
Các chỉ tiêu nghiên cứu
- Dữ liệu lâm sàng: tuổi, giới, lý do vào viện, bệnh sử, tiền sử, cân nặng, chiều cao, huyết áp, tình trạng sốt, phù; các thông tin khi khám về tuần hoàn, hô hấp, tiêu hóa, tiết niệu.
- Dữ liệu cận lâm sàng: Nồng độ protein niệu 24 giờ, tỷ lệ protein/creatinin niệu; nồng độ ure, creatinin, protein và albumin máu - Dữ liệu đa hình đơn nucleotid rs3738423
Hóa chất
Hóa chất dùng cho tách ADN tổng số: E.Z.N.A blood ADN Mini kit (hãng Omega-Biotek).
Hóa chất dùng cho điện di: Ultra Pure Agarose (hãng Invitrogen); TAE 1X;
Ethylene diamine tetra acetic Acid, (EDTA) Disodium Salt, Dihydrate (hãng Affymetrix); 6X ADN loading dye (hãng ThermoScientific); GeneRuler 100 bpPlus ADN Ladder (code: SM0321, hãng ThermoScientific); Lambda ADN/HindIII Marker (code: SM0103, hãng ThermoScientific); Tris base (hãng Bio basic); Acid acetic (hãng Merck).
Hóa chất dùng cho PCR: Cặp mồi được đặt tổng hợp từ hãng IDT, Mỹ; Pfu ADN polymerase (hãng Thermo Scientific); dNTPMix 2 mM (hãng Thermo Scientific); Nước khử ion (hãng Omega Biotek).
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
17 Thiết bị
Cỏc pipet Eppendorf dải 0,5 àl - 10 àl, 10 àl - 100 àl, 100 àl - 1000 àl, hóng: Thermo; Đầu tớp 10 àl, 200 àl, 1000 àl, hóng: Thermo; Ống Eppendorf 1,7 ml, hãng: Thermo; Ống PCR 0,2 ml, hãng: Thermo; Hệ thống điện di Cole-Parmer (Mỹ) ; Máy PCR Prime Thermal Cycler (Anh); Tủ lạnh -300C Panasonic (Nhật Bản); Máy li tâm EBA 21 Hettich Zentrifugen (Đức); Máy lắc VELP Scientifica (Châu Âu); Máy soi gel Cole-Parmer (Mỹ) ; Máy quang phổ NP80 Nanophotometer (Đức).
Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu
Mẫu xét nghiệm sinh hóa nước tiểu 24h: lấy toàn bộ số lượng nước tiểu trong một ngày đêm (đủ 24h). Bô đựng nước tiểu phải có nắp đậy, rửa sạch và được sát khuẩn bằng 5ml dung dịch HCl đậm đặc. Tối hôm trước tắm rửa, vệ sinh sạch bộ phận sinh dục-tiết niệu, 6 giờ sáng bệnh nhân đái bỏ đi, và bắt đầu ghi thời gian. Sau đó cả ngày và đêm nước tiểu được đựng vào bô, kể cả lượng nước tiểu lúc đại tiện cũng phải gom cho vào, 6 giờ sáng hôm sau đi tiểu lần cuối cùng vào bô. Đo thể tích nước tiểu 24h, lấy 5ml để làm xét nghiệm. Bảo quản nước tiểu bằng dung dịch thymol 10% (5ml).
Mẫu xét nghiệm sinh hóa máu: lấy máu buổi sáng, chưa ăn. Lấy 1,5 - 2ml máu tĩnh mạch đựng trong ống nghiệm chống đông bằng Heparin. Bệnh phẩm được vận chuyển ngay đến phòng xét nghiệm để phân tích.
Mẫu cho phân tích gen: lấy 2ml máu toàn phần đựng trong ống nghiệm chống đông bằng EDTA, bảo quản ở -20oC đến khi sử dụng. Kí hiệu mẫu: ống chứa máu phải có đầy đủ thông tin về mã bệnh nhân, tên, tuổi, ngày lấy mẫu. Tất cả thông tin về mẫu máu của bệnh nhân phải được lưu trong sổ bàn giao mẫu và nhật kí thí nghiệm tách DNA tổng số.
Phân tích định lượng sinh hóa máu và nước tiểu
Bệnh phẩm được phân tích tại khoa Sinh hóa, bệnh Viện Nhi Trung Ương.
Bệnh nhân được xét nghiệm tại những mốc thời gian khác nhau: vào viện, ra viện,
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
18
sau ra viện 1 tháng và sau ra viện 6 tháng. Các chỉ số sinh hóa cơ bản được phân tích bao gồm: nồng độ protein niệu, protein/creatinin niệu, protein máu, albumin máu, creatinin máu sử dụng hệ thống phân tích sinh hóa tự động AU2700 (Beckman Coulter).
Phân tích đa hình gen NPHS2
Tách chiết DNA tổng số: Sử dụng E.Z.N.A blood DNA Mini Kit theo quy trình khuyến cáo của hãng. Quy trình tách chiết DNA được trình bày ở Phụ lục 1.
Kiểm tra và định lượng DNA tách chiết: Sự có mặt của DNA được kiểm tra bằng điện di trờn gel agarose 0,7%, đệm TAE 1X. 5 àl DNA được trộn với 1 àl đệm tra mẫu chứa ethidium bromide (50 àg/ml). Điện di được thực hiện với hiệu điện thế 90 volt trong 1 giờ, các băng DNA được phát hiện dưới ánh sáng UV.
Nồng độ và độ tinh sạch của ADN tách chiết được định lượng bằng cách đo mật độ hấp thụ quang ở bước sóng 260 nm (OD260) và 280 nm (OD280). ADN được cho là có độ tinh sạch cao khi giá trị OD 260/ OD 280 nằm trong khoảng 1,8 – 2,0.
Quy trình kiểm tra chất lượng DNA bằng điện di được trình bày ở Phụ lục 2.
Thiết kế mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR: Sử dụng phần mềm PerlPrimer version 1.1.1, chúng tôi tự thiết kế mồi nhân dòng exon 2, đặt tổng hợp hóa học tại hãng IDT (Mỹ).
Exon Trình tự mồi (5’ – 3’) 2
CTCTGACTACTCTGATTTGACTT CTCAAATGTGAACAGGAAGCC
Nhân dòng exon 2 của gen NPHS2 bằng PCR: Nguyên tắc của PCR là tạo lượng lớn các đoạn DNA cần phân tích từ DNA khuôn dựa trên cơ sở hoạt động của enzyme ADN polymerase để tổng hợp sợi mới bổ sung. Sản phẩm PCR được đánh giá chất lượng bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1 %.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
19
Bảng 2.1. Thành phần và chu trình nhiệt PCR nhân dòng exon 2 của gen NPHS2.
Thành phần
Thể tích (àL)
Điều kiện (chu trình nhiệt) dNTP (2mM) 2,5 * Biến tính đầu: 95 oC trong 3’
* Lặp lại 35 chu kì:
- Biến tính: 95 oC – 30”
- Gắn mồi: 56 oC – 30”
- Kéo dài chuỗi: 72 oC – 1’
* Tổng hợp cuối: 72 oC – 5’
* Giữ sản phẩm ở -4 oC
Buffer 10X 2,5
MgSO 4 (25mM) 2
Pfu DNA polymerase (2.5 U/àL)
0,5
DNA 2,5
Mồi xuụi (10 pmol/àl) 0,75 Mồi ngược (10 pmol/àl) 0,75
Nước khử ion 13,5
Tổng thể tích 25
Xỏc định kiểu gen exon 2 của gen NPHS2 bằng giải trỡnh tự: 20 àl sản phẩm được gửi giải trình tự tại hãng IDT (Malaysia). Kết quả giải trình tự được đọc bằng phần mềm BioEdit version 7.1.9 để xác định kiểu gen của mỗi bệnh nhân.
Cách đọc kiểu gen sau khi có kết quả giải trình tự như sau: mỗi nucleotide được thể hiện bằng một đỉnh với màu đặc trưng (A: màu xanh lá cây, C: màu xanh da trời, G: màu đen, T: màu đỏ). Tại vị trí cho mỗi nucleotid, nếu chỉ hiện 1 đỉnh màu thì bệnh nhân có kiểu gen đồng hợp, nếu xuất hiện hai đỉnh màu thì là kiểu gen dị hợp.
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU
20
Trẻ mắc HCTHTP nhập viện (N=149)
Điều trị tấn công 4 tuần Liều prednisolon 2mg/kg/24h
Có thuyên giảm không ?
Điều trị duy trì 4-8 tuần Liều prednisolon 1,5mg/kg/48h
Điều trị tiếp 2 tuần Liều prednisolon 2mg/kg/24h
- Thuyên giảm hoàn toàn - Không tái phát
- Hoặc có tái phát nhưng vẫn đáp ứng thuốc
- Thuyên giảm không hoàn toàn
- Tái phát và kháng thuốc trong những đợt điều trị sau
Không thuyên giảm (Protein/creatinin
>200mg/mmol)
Nhạy cảm thuốc n=58
Kháng thuốc muộn n=35
Kháng thuốc sớm n=56
Đặc điểm chung Chỉ số sinh hóa
Giải trình tự exon 2 Xác định rs3738423
Phân tích mối liên quan
Sơ đồ 2.1: sơ đồ thiết kế nghiên cứu
Có Không
Copyright @ School of Medicine and Pharmacy, VNU