CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất
- Sắc ký lớp mỏng (TLC): Sắc ký lớp mỏng đƣợc thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254S (Merck). Phát hiện chất bằng đ n tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc d ng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% đƣợc phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ đến khi hiện màu.
- Sắc ký cột (CC): Sắc ký cột đƣợc tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel và pha đảo. Silica gel có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh). Pha đảo RP- 18 (150 m, Fuji Silysia Chemical Ltd.). Nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 (Mitsubishi Chem. Ind. Co., Ltd.).
- Sắc kí lỏng hiệu năng cao: Hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao đƣợc sử dụng là AGILENT 1200 HPLC.
2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc
Phương pháp chung để xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất là sự kết hợp xác định giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại bao gồm:
- Phổ khối lượng (MS): Phổ khối lƣợng phun m điện ESI-MS đƣợc đo trên máy Agilent 1100 LC-MSD Trap của Viện Hoá sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS: Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS đo trên máy FT-ICR-Mass spectrophotometer tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; Agilent Accurate mass 6530 QTOF LC/MS, Khoa Dược, Trường Đại học Yonsei, Hàn Quốc.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR: Phổ NMR đo trên máy: Bruker AM500 FT-NMR của Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam; Varian 400 MHz của Khoa Dược, Trường Đại học Yonsei, Hàn Quốc.
Chất nội chuẩn là TMS (Tetramethyl silane).
Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được s dụng bao gồm:
+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT.
+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC, HMBC, 1H-1H COSY, NOESY và ROESY.
+ Dung môi đƣợc sử dụng là CD3OD. Việc lựa chọn dung môi đo phụ thuộc vào bản chất của mẫu, trên nguyên tắc là dung môi phải hòa tan hoàn toàn mẫu đo.
- Độ quay cực []D: Độ quay cực đƣợc đo trên máy JASCO DIP-1000 KUY Polarimeter của Viện Hóa Sinh Biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Phương pháp xác định đường: Các hợp chất đƣợc tiến hành thuỷ phân trong môi trường acid [79]. Sau khi thuỷ phân, phần đường tách ra được silyl hoá để nhận dạng. Các bước tiến hành như sau: Cân mỗi mẫu 2 mg hoà tan trong 1,0 ml dung dịch HCl 1N (HCl trong dioxane/nước, 1/1, v/v). Đun nóng cách thuỷ, có lắp sinh hàn hồi lưu ở nhiệt độ 80oC, trong 3 giờ. Sau đó để nguội dung dịch, trung hoà bằng dung dịch Ag2CO3. Sau khoảng 1 giờ (cho AgCl kết tủa hết), lọc bỏ chất rắn thu lấy dung dịch. Dung dịch thu đƣợc có thể làm khô bằng khí N2 (trong khoảng thời gian từ 2-3 giờ) hoặc cô quay trong chân không với nhiệt độ nồi cách thuỷ là 40oC. Đem hỗn hợp chiết bằng CHCl3 (0,5 ml CHCl3 + 0,5 ml nước, thực hiện chiết lặp lại 2 lần). Loại bỏ lớp CHCl3, thu lấy lớp nước, sau đó làm khô bằng khí N2 và cô quay trong chân không. Tiếp tục hoà tan cặn rắn này bằng 0,1 ml pyridine và thêm vào đó L-cysteine methyl ester hydrochloride 0,06 M. Đun hỗn hợp phản ứng ở 60oC trong bình cách thuỷ có lắp sinh hàn, tiến hành trong 2 giờ. Tiếp tục thêm 0,1 ml trimethylsilylimidazole và đun tiếp hỗn hợp phản ứng trong 1,5 giờ ở 60oC. Phân bố hỗn hợp phản ứng trong hệ dung môi n-hexane/nước (0,1ml x 2 lần), thu lấy phần n- hexane. Với các đường chuẩn cũng tiến hành các thực nghiệm tương tự như trên.
Các dẫn xuất silyl hóa của các đường được đối chiếu với các dẫn xuất silyl hóa của các đường chuẩn bằng phương pháp GC.
Chương trình chạy GC: Máy GC - model: Shimazu-2010; cột: SPB-1 (0,25 mm x 30m); detector FID: 300oC; khí mang: He 30ml/phút; nhiệt độ cột: 210oC;
nhiệt độ buồng tiêm: 270oC.
Máy GC - model Shimazu-2010 Khoa Dược, Trường Đại học Yonsei, Hàn Quốc.
2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào
a) Thí nghiệm đánh giá hoạt tính gây độc tế bào theo phương pháp MTT của Tim Mosmann
Các chất phân lập từ loài G. glomerulatum đƣợc đánh giá hoạt tính gây độc trên các dòng tế bào A-549 (ung thư phổi người), MCF-7 (ung thư vú người), OVCAR (ung thư buồng trứng người) và HT-29 (ung thư đại tràng người), các thí nghiệm này đƣợc thực hiện tại Khoa Dƣợc, Đại học Quốc gia Chungnam, Hàn Quốc.
Hoạt tính gây độc tế bào được đánh giá theo phương pháp MTT được mô tả lần đầu tiên vào năm 1983 bởi Tim Mosmann. Đây là phương pháp đánh giá khả năng sống sót của tế bào thông qua khả năng khử 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5- diphenyltetrazolium bromide (MTT, màu vàng) thành phức hợp formazan (màu tím đen) bởi hoạt động của enzyme dehydrogenase trong ty thể [80].
Các tế bào A-549, MCF-7, OVCAR, HT-29 được nuôi cấy trong môi trường RPMI 1640 cú bổ sung 10% FBS, 100 U/mL penicillin và 100 àg/mL streptomycin trong điều kiện 37oC và CO2 5%. Thí nghiệm MTT đƣợc tiến hành nhƣ sau: các tế bào ung thƣ ở trên (3x105 tế bào/mL) đƣợc xử lý với các hợp chất thử nghiệm cũng như chất đối chứng dương mitoxantrone trong 72 giờ ở các nồng độ 0,01, 0,1, 1, 10, 50 và 100 àM. Sau thời gian ủ, 0,5 àg/ml MTT đƣợc thờm vào mỗi giếng và ủ trong 4 giờ ở 37oC. Các đĩa tế bào sau đó đƣợc ly tâm ở tốc độ 1000 rpm trong 5 phút ở nhiệt độ phũng, sau đú mụi trường nuụi cấy được hỳt bỏ. 150 àL dimethylsulfoxide (DMSO) 10% đƣợc thêm vào mỗi giếng để hòa tan các tinh thể formazan. Các đĩa sau đó được đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 540 nm sử dụng máy đọc micro- plates (Amersham Pharmacia Biotech., USA). Các thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần và các giá trị trung bình đƣợc tính toán. Kết quả tính đƣợc là phần trăm ức chế - thể hiện thông qua giá trị độ hấp thụ của các mẫu đƣợc xử lý với chất thử so với đối chứng không được xử lý với chất thử. Đường cong hoạt tính theo nồng độ được xây dựng và nồng độ gây ức chế 50% tế bào đƣợc xác định cho mỗi hợp chất.
b) Thí nghiệm đánh giá hoạt tính gây độc tế bào theo phương pháp của Monks Các chất phân lập từ loài G. hirsutum đƣợc đánh giá hoạt tính gây độc trên các dòng tế bào A-549 (ung thư phổi người), MCF-7 (ung thư vú người), SW-626 (ung
thư buồng trứng người) và HepG2 (ung thư gan người), các thí nghiệm này được thực hiện tại Phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks (1991) [81].
Phép thử tiến hành xác định hàm lƣợng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo đƣợc khi thành phần protein của tế bào đƣợc nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo đƣợc tỉ lệ thuận với lƣợng SRB gắn với phân tử protein, do đó lƣợng tế bào càng nhiều (lƣợng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thử đƣợc thực hiện trong điều kiện cụ thể nhƣ sau:
Chất thử (10 L) pha trong DMSO 10% đƣợc đƣa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ sàng lọc là 100 g/mL. Chất thử có hoạt tính đƣợc xác định IC50 nhờ dải nồng độ 100 g/ml; 20 g/ml; 4 g/mL; 0,8 g/mL. Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho ph hợp với thí nghiệm. Thêm vào các giếng thí nghiệm lƣợng tế bào ph hợp (trong 190 l môi trường) và để chúng phát triển trong vòng từ 3-5 ngày. Một khay 96 giếng khác không có chất thử nhƣng có tế bào ung thƣ (190l) sẽ đƣợc sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, đĩa đối chứng ngày 0 sẽ đƣợc cố định tế bào bằng Trichloroacetic acid – TCA. Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, tế bào đƣợc cố định vào đáy giếng bằng TCA trong 30 phút, đƣợc nhuộm bằng SRB trong 1 giờ ở 37 oC. Đổ bỏ SRB và các giếng thí nghiệm đƣợc rửa 3 lần bằng 5% acetic acid rồi để khô trong không khí ở nhiệt độ phòng. Cuối c ng, sử dụng 10 mM dung dịch base Tris để hòa tan lƣợng SRB đã bám và nhuộm các phân tử protein, đƣa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về hàm lượng màu của chất nhuộm SRB qua phổ hấp phụ ở bước sóng 515 nm.
Các phép thử đƣợc lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine (Sigma) luôn được sử dụng như là chất đối chứng dương và được thử nghiệm ở các nồng độ: 10 g/mL, 2 g/mL, 0,4 g/mL và 0,08 g/mL. DMSO 10% luôn đƣợc sử dụng nhƣ đối chứng âm.
* Cách tính toán một số giá trị như sau:
Giá trị CS: Là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó của chất thử tính theo % so với đối chứng. Dựa trên kết quả đo đƣợc của chúng OD (ngày 0), DMSO 10% và so sánh với giá trị OD khi trộn mẫu để tìm giá trị CS (%) theo công thức:
% ức chế = 100% - CS%
Giá trị CS% sau khi tính theo công thức trên, đƣợc đƣa vào tính toán Excel để tìm ra % trung bình ± độ lệch tiêu chuẩn của phép thử đƣợc lặp lại 3 lần theo công thức của Ducan nhƣ sau: Độ lệch tiêu chuẩn
=
Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS < 50%) sẽ đƣợc chọn ra để thử nghiệm tiếp để tìm giá trị IC50.
Giá trị IC50: D ng giá trị CS của 10 thang nồng độ, dựa vào chương trình Table curve theo thang giá trị logarit của đường cong phát triển tế bào và nồng độ chất thử để tính giá trị IC50. Kết quả tính đƣợc là phần trăm ức chế - thể hiện bằng sự giảm hấp thụ của các mẫu đƣợc xử lý với chất thử so với đối chứng không đƣợc xử lý với chất thử. Đường cong hoạt tính theo nồng độ được xây dựng và nồng độ gây ức chế 50% tế bào đƣợc xác định cho mỗi hợp chất.