CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.3. Phân lập các hợp chất
2.3.1. Phân lập các hợp chất từ loài G. glomerulatum
Cành và lá loài G. glomerulatum đƣợc sấy khô, nghiền nhỏ thu đƣợc 2,0 kg.
Bột khô này đƣợc ngâm chiết với methanol (3 lần x 5 lít) bằng thiết bị chiết siêu âm (mỗi lần 15 giờ). Dịch chiết đƣợc thu lại, lọc qua giấy lọc rồi tiến hành cất thu hồi dung môi dưới áp suất thấp thu được 80 g cặn chiết methanol. Cặn chiết này được
phân bố đều trong hai lít nước rồi tiến hành chiết lần lượt với chloroform và ethyl acetate. Các dịch chiết này được cất thu hồi dung môi dưới áp suất thấp thu được cặn chloroform (GGL1, 10 g), ethyl acetate (GGL2, 25 g) và cặn nước (GGL3, 45 g). Nhận thấy phần cặn thu được từ lớp nước có khối lượng lớn nhất, dự đoán saponin sẽ là lớp chất chính khi phân lập loài này. Kiểm tra vết chất của các cặn chiết trên sắc ký bản mỏng silica gel, RP18 cho thấy các cặn chiết GGL1 chủ yếu chứa các chất dầu béo. Các công bố về thành phần hóa học của chi này cũng ít tập trung vào phần cặn chiết chloroform và kết quả thu đƣợc từ phần cặn chiết này thường không có những lớp chất hay [14]. Tiến hành kiểm tra vết chất của cặn GGL2 và GGL3 thì nhận thấy hầu hết các chất là tr ng nhau. Cặn chiết GGL3 có khối lƣợng thu đƣợc lớn nhất và các vết chất chủ yếu tập trung ở đây. Vì vậy, chúng tôi tập trung phân lập các hợp chất ở cặn chiết GGL3.
Hình 2.3. Sơ đồ chiết các phân đoạn mẫu G. glomerulatum
Cặc lớp nước GGL3 (45,0 g) được đưa lên cột diaion HP-20 để loại đường và muối vô cơ bằng nước, sau đó được rửa giải bằng methanol trong nước với nồng độ tăng dần (25%, 50%, 75% và 100%) thu đƣợc năm phân đoạn, GG3A–
GG3E. Phân đoạn GG3C đƣợc tẩm với silica gel rồi đƣa lên cột sắc ký với hệ dung môi rửa giải chloroform/methanol (20/1, 10/1, 5/1, 2,5/1, v/v) thu đƣợc bốn phân đoạn, GG3C1–GG3C4.
Phân đoạn GG3C3 tiếp tục phân tách trên cột sắc ký RP-18 với hệ dung môi acetone/nước (1/1, v/v) thu được ba phân đoạn nhỏ hơn, GG3C3A-GG3C3C.
Phân đoạn GG3C3A được tinh chế bằng phương pháp HPLC, sử dụng cột J’sphere ODS H-80 (250 mm x 20 mm, 4μm) với dung môi rửa acetone nitrile/nước (1/1,
v/v) với tốc độ dòng chảy 4 ml/phút thu đƣợc hợp chất GG1 (25,0 mg, thời gian lưu tR = 31,16 phút) và hợp chất GG2 (21,0 mg, thời gian lưu tR = 33,56 phút).
Tinh chế bằng phương pháp HPLC, với điều kiện xử lí tương tự phân đoạn GG3C3A, từ phân đoạn GG3C3B thu được hợp chất GG8 (31,0 mg, thời gian lưu tR = 13,51 phút) và hợp chất GG10 (36,0 mg, thời gian lưu tR = 14,53 phút), từ phân đoạn GG3C3C thu được hai hợp chất là: GG7 (28,0 mg, thời gian lưu tR = 26,06 phút) và hợp chất GG9 (30,0 mg, thời gian lưu tR = 22,72 phút).
Hình 2.4. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn nước loài G. glomerulatum
Phân đoạn GG3C4 đƣợc đƣa lên cột sắc ký RP-18 với hệ dung môi rửa giải acetone/nước (1/1, v/v) thu được ba phân đoạn, GG3C4A–GG3C4C. Tinh chế bằng phương pháp HPLC, sử dụng cột J’sphere ODS H-80 (250 mm x 20 mm, 4μm) với dung môi rửa acetone nitrile/nước (1/1, v/v) với tốc độ dòng chảy 4 ml/phút, từ phân đoạn GG3C4A thu được ba hợp chất là: GG4 (5,0 mg, thời gian lưu tR = 24,13 phút), hợp chất GG5 (10,0 mg, thời gian lưu tR = 27,58 phút) và hợp chất GG6 (36,0 mg, thời gian lưu tR = 34,95 phút); từ phân đoạn GG3C4B thu được hợp chất GG3 (10,0 mg, thời gian lưu tR = 32,13 phút).
2.3.2. Phân lập các hợp chất từ loài G. hirsutum
Cành và lá của loài G. hirsutum đƣợc sấy khô, nghiền nhỏ thu đƣợc 4,0 kg bột khô. Bột khô này đƣợc ngâm chiết với methanol (3 lần x 7 lít) bằng thiết bị chiết siêu âm (mỗi lần 15 giờ). Các dịch chiết đƣợc gom lại, lọc qua giấy lọc và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được 255 g cặn chiết methanol. Cặn chiết này được phân bố đều trong một lít nước rồi tiến hành chiết lần lượt với dichloromethane và ethyl acetate. Các dịch chiết dichloromethane và ethyl acetate được cất loại bỏ dung môi dưới áp suất giảm thu được cặn dichloromethane (GHL1, 30,0 g), cặn ethyl acetate (GHL2, 120,0 g) và lớp nước (GHL3, 70,0 g). Kiểm tra vết chất của các cặn chiết trên sắc ký bản mỏng silica gel, RP18 cho thấy các cặn chiết GHL1 cũng chủ yếu chứa các chất dầu béo. Tiến hành kiểm tra vết chất của cặn GHL2 và GHL3 thì nhận thấy các chất cơ bản là trùng nhau. Cặn chiết GHL2 có khối lƣợng thu đƣợc lớn nhất và các vết chất chủ yếu tập trung ở đây. Vì vậy, chúng tôi tập trung phân lập các hợp chất ở cặn chiết GHL2.
Hình 2.5. Sơ đồ chiết các phân đoạn mẫu G. hirsutum
Cặn ethyl acetate GHL2 (120 g) đƣợc tẩm với silica gel rồi đƣa lên cột sắc ký với hệ dung môi rửa giải gradient dichlomethane/methanol (100/1, 30/1, 10/1, 5/1, 1/1, 0/1, v/v) thu đƣợc sáu phân đoạn, GH2A-GH2F. Phân đoạn GH2C đƣợc đƣa lên cột sắc ký silica gel với hệ dung môi rửa giải dichlomethane/methanol (8/1, v/v) thu đƣợc hai phân đoạn nhỏ hơn, GH2C1-GH2C2. Hợp chất GH1 (12,0 mg)
thu đƣợc khi phân tách phân đoạn GH2C1 trên cột sắc ký silica gel với hệ dung môi rửa giải ethyl acetate/methanol/nước (12/1/0,01, v/v/v).
Phân đoạn GH2D tiếp tục đƣợc đƣa lên cột sắc ký silica gel và rửa giải với hệ dung môi dichlomethane/methanol/nước (5/1/0,1, v/v/v) thu được ba hợp phần nhỏ hơn, GH2D1-GH2D3. Hợp chất GH4 (18,0 mg) đƣợc phân lập từ phân đoạn GH2D1 trên cột sắc ký silica gel với hệ dung môi rửa giải ethyl acetate/methanol/nước (6/1/0,01, v/v/v). Phân đoạn GH2D2 được đưa lên cột sắc ký RP-18, rửa giải với hệ dung môi methanol/nước (3,5/1, v/v) thu được hợp chất GH5 (32,0 mg). Tinh chế phân đoạn GH2D3 trên cột sắc ký silica gel với hệ dung môi rửa giải dichlomethane/methanol/nước (6/1/0,05, v/v/v) thu được hợp chất GH3 (21,0 mg). Phân đoạn GH2E tiếp tục đƣợc đƣa lên cột sắc ký silica gel với hệ dung môi rửa giải dichlomethane/methanol/nước (6/1/0,05, v/v/v) thu được phân đoạn GH2E1, tiếp tục phân lập GH2E1 trên cột RP-18 với hệ dung môi rửa giải methanol/nước (3/1, v/v) thu được hợp chất GH2 (9 mg).
Hình 2.6. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn ethyl acetate loài G. hirsutum
Như vậy, sử dụng phối hợp các phương pháp sắc ký cột silica gel pha thường, pha đảo, sắc ký bản mỏng, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), bằng các hệ dung môi thích hợp đã phân lập đƣợc 10 hợp chất từ loài G. Glomerulatum (GG1-GG10) và 5 hợp chất từ loài G. hirsutum (GH1-GH5).