PHẦN 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.4. Nghiên cứu, đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển khi áp dụng công nghệ nuôi trồng nấm mỡ lên nấm Dictyophora indusiata
2.5.5. Phương pháp xác định hàm lượng xơ theo TCVN 9050:2012[44]
Lấy mẫu
Mẫu không bị hƣ hỏng hoặc thay đổi trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản.
64
Cách tiến hành Bước 1: Chuẩn bị mẫu thử
Đồng hóa mẫu thử nghiệm và sấy khô qua đêm trong tủ sấy chân không ở 70 °C (5.9) hoặc trong tủ sấy ở 105 °C, làm nguội trong bình hút ẩm và nghiền mẫu đến cỡ hạt từ 0,3 mm đến 0,5 mm.
Nếu mẫu thử không thể làm nóng được thì làm đông khô trước khi nghiền.
Nếu hàm lƣợng chất béo lớn hơn 10 % gây khó khăn cho việc nghiền mẫu thì loại bớt chất béo bằng ete dầu mỏ (chiết 3 lần, mỗi lần dùng 25 ml cho mỗi gam mẫu thử) trước khi nghiền. Ghi lại hao hụt khối lượng do loại bỏ chất béo và hiệu chỉnh thích hợp cho chất xơ cuối cùng thu đƣợc.Bảo quản mẫu đã nghiền nhỏ trong bình hút ẩm cho đến khi tiến hành phân tích.
Đối với các mẫu có hàm lượng đường cao thì loại đường trước khi xác định hàm lƣợng xơ bằng cách chiết mỗi mẫu khoảng 2 lần đến 3 lần, mỗi lần dùng 10 ml etanol 85 % cho mỗi gam mẫu thử, gạn và sấy khô qua đêm ở nhiệt độ 40 °C.
Bước 2: Phép thử trắng
Chạy hai phép thử trắng cho một phép xác định để kiểm tra phần cặn của thuốc thử.
Bước 3: Phân hủy mẫu thử
Cân lặp lại hai lần mỗi lần 1,000 g ± 0,005 g mẫu thử (m1 và m2), chính xác đến 0,1 mg, cho vào cốc có mỏ 400 ml (hoặc 600 ml). Thêm 40 ml dung dịch đệm MES- TRIS pH 8,2. Khuấy trên máy khuấy từ cho đến khi dung dịch mẫu phân tán hoàn toàn (nếu tạo thành các màng thì mẫu thử sẽ không thể tiếp xúc đƣợc với các enzym).
65
Thêm 50 ml dung dịch a-amylaza bền nhiệt , khuấy với tốc độ thấp. Đậy cốc có mỏ bằng lá nhôm và ủ trong nồi cách thủy ở nhiệt độ từ 95 °C đến 100 °C khoảng 15 min trong khi vẫn khuấy liên tục. Bắt đầu tính thời gian khi nồi cách thủy đạt nhiệt độ 95 °C (thường khoảng 35 min là đủ).
Lấy các cốc có mỏ ra khỏi nồi cách thủy và để nguội đến 60 °C. Tháo lá nhôm ra. Dùng thìa để lấy hết phía bên trong cốc và phần dưới đáy cốc. Tráng rửa thành cốc và thìa bằng 10 ml nước.
Thêm 100 ml dung dịch proteaza vào mỗi cốc. Đậy cốc bằng lá nhôm và ủ trong nồi cách thủy 30 min ở 60 °C ± 1 °C trong khi vẫn khuấy liên tục. Bắt đầu tính thời gian khi nồi cách thủy đạt nhiệt độ 60 °C.
Tháo lá nhôm ra, dùng bộ phân phối lấy 5 ml dung dịch axit clohydric 0,561 M vào mỗi cốc trong khi vẫn khuấy. Chỉnh pH đến khoảng từ 4,0 đến 4,7 ở 60 °C bằng dung dịch NaOH 1 M hoặc dung dịch HCl 1 M .
CHÚ Ý: Cần kiểm tra và điều chỉnh độ pH trong khi các dung dịch ở nhiệt độ 60 °C vì pH sẽ tăng lên ở nhiệt độ thấp hơn. Hầu hết các mẫu ngũ cốc, sản phẩm dạng hạt và các sản phẩm rau không cần điều chỉnh pH. Kiểm tra thường xuyên pH của mẫu trắng, nếu nằm ngoài khoảng pH thích hợp thì kiểm tra các dung dịch thử.
Thêm 300 ml dung dịch amyloglucosidaza trong khi vẫn khuấy. Tháo lá nhôm ra và ủ trong nồi cách thủy 30 min ở nhiệt độ 60 °C ± 1 °C trong khi vẫn khuấy liên tục. Bắt đầu tính thời gian khi nồi cách thủy đạt nhiệt độ 60 °C.
Bước 4: Xác định xơ tổng số
Thêm 225 ml etanol 95 % sau khi làm nóng ở nhiệt độ 60 °C vào từng dung dịch mẫu thử đã phân hủy. Tỉ lệ giữa etanol và dung dịch mẫu thử là 4:1. Lấy cốc có
66
mỏ ra khỏi nồi cách thủy và đậy cốc bằng tấm lá nhôm lớn. Để cho hình thành kết tủa trong 1 h ở nhiệt độ phòng.
Làm ướt và phân phối lại celite dưới đáy trong chén lọc đã cân trước đó, sử dụng 15 ml etanol 78 % từ chai rửa. Rút celite đều sang thủy tinh xốp bằng cách hút vào chén.
Lọc dịch phân hủy enzym đã xử lí bằng etanol sang chén lọc. Sử dụng chai rửa với etanol 78 % và dao trộn bằng cao su, để chuyển định lƣợng tất cả các hạt còn lại sang chén lọc.
CHÚ THÍCH: Nếu mẫu thử tạo thành keo, giữ lại chất lỏng thì dùng dao trộn để phá vỡ.
Sử dụng bộ lọc chân không, rửa cặn hai lƣợt, mỗi lƣợt dùng các phần 15 ml của từng dung dịch etanol 78 % , etanol 95 % và axeton . Sấy khô chén lọc cùng với cặn qua đêm trong tủ sấy ở 105 °C. Làm nguội chén lọc 1 h trong bình hút ẩm . Cân chén lọc cùng với lƣợng chất xơ và celite, chính xác đến 0,1 mg và tính khối lƣợng còn lại bằng cách trừ đi khối lƣợng của chén lọc với celite.
Dùng một trong hai phần mẫu kép để xác định hàm lƣợng protein theo AOAC 960.52, sử dụng hệ số chuyển đổi N x 6,25. Để phân tích tro, nung mẫu kép thứ hai trong 5 h ở 525 °C. Làm nguội trong bình hút ẩm, cân chính xác đến 0,1 mg. Lấy khối lƣợng thu đƣợc trừ đi khối lƣợng của chén và celite để xác định khối lƣợng tro.
Bước 5: Xác định xơ không hòa tan
Làm ướt và phân phối lại celite dưới đáy trong chén lọc đã cân trước, sử dụng khoảng 3 ml nước. Rút celite đều sang thủy tinh xốp bằng cách hút vào chén.
67
Lọc dịch phân hủy enzym qua chén lọc sang bình lọc. Tráng rửa cốc có mỏ và tráng rửa cặn 2 lần bằng 10 ml nước ở 70 °C. Gộp dịch lọc và nước rửa, chuyển vào cốc có mỏ 600 ml đã cân trước và giữ lại để xác định xơ hòa tan.
Sử dụng bộ lọc chân không, rửa cặn hai lƣợt, mỗi lƣợt dùng các phần 15 ml của từng dung dịch etanol 78 % , etanol 95 % và axeton.
CHÚ THÍCH: Nếu không rửa cặn IDF bằng etanol 78 %, etanol 95 % và axeton thì giá trị IDF thu đƣợc có thể cao hơn.
Sử dụng các mẫu kép để xác định hàm lƣợng protein và tro . Bước 6: Xác định xơ hòa tan
Tiến hành như phép xác định chất xơ không hòa tan đến bước kết hợp dịch lọc và rửa nước vào cốc có mỏ 600 ml đã cân trước. Cân cốc có mỏ với hỗn hợp đã gộp của dịch lọc và nước và ước tính các thể tích.
Thêm 4 thể tích etanol 95 % đã làm nóng sơ bộ đến 60 °C. Sử dụng phần etanol 60 °C để rửa bình lọc từ phép xác định chất xơ không hòa tan (IDF). Ngoài ra, chỉnh lượng hỗn hợp của dịch lọc và nước đến 80 g bằng cách bổ sung nước và thêm 320 ml etanol 95 % ở nhiệt độ 60 °C. Để hình thành kết tủa 1 h ở nhiệt độ phòng.
Thực hiện tiếp nhƣ phép xác định xơ tổng số 7.4.1, từ đoạn “làm ƣớt và phân phối lại celite...”.
Tính kết quả
Hàm lƣợng xơ không hòa tan
Hàm lƣợng xơ không hòa tan, XIDF, tính bằng gam trên 100 g (g/100 g), theo công thức sau:
68
(1) Trong đó:
m1 và m2 là khối lƣợng của các phần mẫu thử , tính bằng miligam (mg);
mR1 và mR2 là khối lƣợng cặn của các phần mẫu thử , tính bằng miligam (mg);
mP và mA là khối lượng của protein và tro tương ứng, xác định được trên các cặn của mẫu thử thứ nhất và thứ hai, tính bằng miligam (mg);
mB là khối lƣợng xơ không hòa tan có trong cặn của thuốc thử, tính bằng miligam (mg), đƣợc tính từ phép thử trắng theo công thức (2):
(2) Trong đó:
mBR1 và mBR2 là khối lƣợng cặn, đối với các phép thử trắng, tính bằng miligam (mg);
mBP và mBA là khối lượng tương ứng của protein và tro, xác định được trên các cặn của mẫu trắng lần thứ nhất và lần thứ hai, tính bằng miligam (mg).
Hàm lƣợng xơ hòa tan
Hàm lƣợng xơ hòa tan, XSDF, tính bằng gam trên 100 g (g/100 g), xác định tương tự như xơ không hòa tan theo công thức xác định chất sơ không hòa tan .
69 Hàm lƣợng xơ tổng số
Hàm lƣợng xơ tổng số = Hàm lƣợng xơ hòa tan + Hàm lƣợng xơ không hòa tan XTDF = XIDF + XSDF