CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2. Xây dựng hệ thống tài liệu GMP-WHO áp dụng cho nhà máy sản xuất
3.2.1 Quy trình sản xuất sản phẩm Bacillus subtilis (GMP 1)
Dưới đây là bảng mô tả quy trình sản xuất và các quy phạm sản xuất của sản phẩm Bacillus sutilis (GMP 1) trên hệ thống lên men 300 lít.
31
Bảng 3.6: Quy trình sản xuất và các quy phạm sản xuất của sản phẩm Bacillus subtilis (GMP1)
Người thực hiện Trình tự công việc Tên GMP
Bộ phận sản xuất
Bộ phận sản xuất GMP.1.1
Bộ phận sản xuất GMP.1.2
Bộ phận sản xuất GMP.1.3
Bộ phận sản xuất GMP.1.4
Bộ phận sản xuất GMP.1.5
Bộ phận QC GMP.1.6
Bộ phận sản xuất Bộ phận Kho
Chủng giống
Nhân chủng
Kiểm soát chất lượng
Sản phẩm Lên men
Lọc
Sấy phun
Dán nhãn, đóng gói
Nguyên liệu
32
Nội dung chi tiết các GMP được xây dựng cho sản phẩm Bacillus subtilis như sau:
GMP.1.1: Nhân chủng a. Mục đích
Đây là giai đoạn cấy giống vi sinh vật thuần khiết từ ống giữ giống sang đĩa thạch để hoạt hóa, sau đó chọn khuẩn lạc cấy chuyển vào bình tam giác chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp, nuôi cấy trong phòng thí nghiệm, nhằm đáp ứng đủ lượng giống cần thiết cho bước tiếp theo.
b. Phân công trách nhiệm
- Trưởng bộ phận sản xuất có trách nhiệm phân công nhân viên thực hiện công đoạn nhân chủng.
- Nhân viên bộ phận sản xuất có trách nhiệm tuân thủ theo GMP này.
- Bộ phận QC kiểm tra nguyên liệu theo đúng GMP.1.6- “Bảng chỉ tiêu chất lượng áp dụng cho sản phẩm Bacillus subtilis - GMP.1”
c. Các thủ tục cần tuân thủ
Các thủ tục cần thực hiện trong GMP.1.2 – “Nhân chủng” và mô tả chi tiết các thủ tục đó như bảng sau:
Bảng 3.7: Bảng mô tả các thủ tục cần thuân thủ trong công đoạn nhân chủng cho sản phẩm Bacillus subtilis- GMP.1
Tiến hành Nội dung chi tiết Kết quả cần đạt đƣợc
1. Chuẩn bị môi trường, dụng cụ nuôi cấy Chuẩn bị môi
trường
- Môi trường đổ đĩa thạch.
- Môi trường lỏng trong bình schott.
Các bước thực hiện theo “Hướng dẫn chuẩn bị môi trường” và ghi chép vào “Sổ chuẩn bị môi trường”
Các loại môi trường phải vô trùng đúng tiêu chuẩn.
Chuẩn bị dụng cụ
- Que cấy một lần, đĩa petri nhựa dùng 1 lần, que trang nhựa.
- Bình tam giác 1000ml, 250ml có khía.
- Hộp đầu côn, pipet thủy tinh 5ml, 10ml, 1ml.
Các dụng cụ phải được hấp tiệt trùng.
33 2. Cấy ria chủng ra đĩa thạch
Chuẩn bị:
Đĩa thạch chứa môi trường đã được hấp tiệt trùng.
Que cấy dùng 1 lần.
- Người thực hiện phải mặc áo blouse, đeo khẩu trang và đi găng tay.
- Lấy ống chủng sản xuất từ tủ lạnh -81oC chuyển ra thực hiện trong Tủ an toàn sinh học.
- Mở ống chủng, lấy que cấy chấm vào ống chủng, nhanh chóng đóng nắp ống chủng. Que cấy đã chấm vào ống chủng được cấy ria trên đĩa thạch, đường cấy được thực hiện sao cho tách được khuẩn lạc đơn sau khi nuôi trong tủ ấm.
- Đĩa sau khi cấy ria được đem nuôi trong tủ ấm ở 37oC.
- Ghi chép vào “Sổ kiểm soát chủng giống”
Tách được các khuẩn lạc đơn riêng rẽ trên đĩa thạch.
3. Chọn khuẩn lạc đơn nuôi lắc trong bình tam giác
Chuẩn bị - Môi trường nuôi cấy trong bình tam giác tiệt trùng với thể tích 10%.
- Que cấy vô trùng.
- Các thao tác phải thực hiện trong Tủ an toàn sinh học.
Cấy chuyển vào bình tam giác.
- Dùng que cấy vô trùng, lấy 1 khuẩn lạc điển hình cho vào môi trường trong bình tam giác.
- Đem nuôi lắc ở nhiệt độ và tốc độ lắc theo yêu cầu:
37o/250 rpm/5-6 giờ.
Thu được môi trường chứa để đem nuôi tăng sinh.
4. Kiểm soát chất lượng trước khi cấp chủng Kiểm tra chất
lượng giống
- Lấy bình tam giác từ máy lắc ổn nhiệt, thực hiện lấy mẫu cuối cùng trong Tủ ATSH.
- Đem đo OD (600nm), kiểm tra độ nhiễm khuẩn bằng cách soi hiển vi
- Cấy kiểm tra nhiễm, kết quả được ghi chép trong
“Phiếu kết quả thử nghiệm”.
OD600nm phải nằm trong giới hạn:
0.4 <OD600nm<1.0 Không được phép tạp nhiễm.
5. Kết thúc Kết thúc quá trình tăng sinh giống
- Bàn giao bình tam giác chứa chủng cấp 1 cho bộ phận lên men để thực hiện công tác cấp chủng.
- Đọc kết quả cấy kiểm tra nhiễm. Nếu có nhiễm, lập tức báo cáo với Trưởng bộ phận QC và QA để xử lý.
- Hoàn thiện Hồ nhân chủng, sổ sách liên quan và chuyển về Trưởng bộ phận sản xuất.
Thu được lượng giống theo yêu cầu và không bị tạp nhiễm.
Các hồ sơ biểu mẫu được ghi chép đầy đủ.
34 d. Biểu mẫu giám sát
STT Kí hiệu Tên hồ sơ Thời gian lưu Nơi lưu
1 BM-NC-02.01 Hồ sơ nhân chủng 3 năm Phòng QA
2 BM-QC-01.01 Phiếu kết quả thử nghiệm 3 năm Phòng QA 3 BM-NC-01.01 Sổ kiểm soát chủng giống 3 năm Phòng QA 4 BM-LM-02.01 Sổ chuẩn bị môi trường 3 năm Phòng QA
GMP.1.2: Lên men a) Mục đích
Là công đoạn nuôi cấy vi sinh vật để chúng tạo sinh khối vi sinh vật dạng bào tử.
Tại BioSpring thực hiện việc lên men chìm, vi sinh vật được nuôi cấy ở môi trường dịch thể với các điểu kiện thuận lợi để phát triển.
b) Phân công trách nhiệm
- Trưởng bộ phận sản xuất có trách nhiệm phân công nhân viên thực hiện công đoạn lên men, đảm bảo sự có mặt của nhân viên trong suốt quá trình lên men.
- Nhân viên bộ phận sản xuất có trách nhiệm tuân thủ theo GMP này.
- Bộ phận QC kiểm tra nguyên liệu theo đúng GMP.1.6 - “Bảng chỉ tiêu chất lượng áp dụng cho sản phẩm Bacillus subtilis- GMP.1”.
c) Các thủ tục cần tuân thủ - Chuẩn bị nguyên liệu
35
Bảng 3.8: Định mức các loại nguyên vật liệu dùng cho sản xuất sản phẩm Bacillus subtilis (Trên 200 lít môi trường)
STT Nguyên liệu Khối lƣợng/ Thể tích Chuẩn bị
1 BS1 1600 gr Cân nguyên liệu vào bình đựng sạch,
sau đó hòa tan với nước RO. Cuối cùng cấp trực tiếp vào nồi lên men.
2 M4 200 gr
3 NaOH 1N 1.6 ml
4 M1 16 ml Mỗi thành phần phải để riêng ra một
bình và khử trùng trước khi sử dụng.
Khử trùng ở 121oC trong 15 phút, sau đó để nguội về nhiệt độ phòng.
Cấp môi trường khoáng bằng phương pháp vô trùng vào nồi lên men ngay trước khi cấp chủng giống.
5 M2 20 ml
6 M3 180 ml
Lưu ý: Do thông tin được yêu cầu bảo mật, nên toàn bộ nguyên liệu sử dụng trong bảng trên đã được mã hóa.
- Thủ tục cần tuân thủ:
Bảng 3.9: Bảng mô tả các thủ tục cần thuân thủ trong công đoạn lên men cho cho sản phẩm Bacillus subtilis- GMP.1
Tiến hành Nội dung chi tiết Kết quả cần đạt đƣợc
1. Kiểm tra điều kiện hoạt động của thiết bị lên men Kiểm tra nguồn
điện, khởi động
- Bật Atomat nguồn cung cấp điện cho máy.
- Bật công tắc nguồn trên tủ điều khiển.
Atomat hoạt động bình thường, màn hình điều khiển khởi động.
Mở các nguồn cấp
- Mở các van nguồn Steam, air, nước, thoát khí - Kiểm tra áp lực ở các đồng hồ:
Số 1 (hơi nóng) 3,0 - 5,0 bar Số 2 (hơi nóng) 2,5- 3,0 bar
Các nguồn cấp và các van cấp hoạt động bình thường
36
Số 3 (khí nén) 2,5 - 5,0 bar - Nước RO : 1000L± 50 3. Tiệt trùng thiết bị
Tiệt trùng nồi lên men
- Van W1, W3, A1: Đóng
- Trên màn hình, cửa sổ Temp, để nút AUTO/MAN màu xám
- Khóa van W7 Mở van W8
- Trên desktop, cửa sổ Sterillize, ấn STOP →Chọn YES →CONFIRM (chữ TQ) bên trái màn hình.
- Đóng van : AI1, WS1 - Mở ST1 trên màn hình
- Mở công tắc khuấy ở cửa tủ điều khiển.
- Mở cửa sổ Agit, chọn tốc độ khuấy 50 Rpm→Chọn Auto
- Mở van S1 từ từ .Chờ đường ống ở phần van xả W8 nóng lên, rồi khóa W8 lại.Chỉnh S1 sao cho đồng hồ áp chỉ áp suất từ 0.12 – 0.2 Mpa.Thấp nhất là 0.12 Mpa.Khi nhiệt độ tăng lên T= 95 oC, mở van A1, A2 van xả nước ngưng bình lọc khí ra, mở nhỏ van khí thải ra.
- Mở van 1, 2, 3
- Mở van ST2 và FO1 trên màn hình, mở từ từ van S2 ( mở nhỏ), mở nhỏ van S4.
- Kiểm tra đường ống qua cácvan1,2, 3 nóng lên thì đóng chúng lại rồi mở nhỏ ra.
- Chỉnh S1 sao cho đồng hồ áp kế chỉ: P = 0.12 Mpa.
- Giữ P = 0.12 Mpa để đủ áp nâng nhiệt lên 125 oC.
- Giữ nhiệt độ trong thời gian 60 phút.
- Tiến hành song song tiệt trùng đường lấy mẫu và đường thu hoạch.
- Mở van khí áp kếMở van AI1, 1,2,3.( khi nhiệt
Thiết bị lên men được tiệt trùng đảm bảo vô trùng
37 độ <100oC thì đóng), mở FO1.
- Kết thúc tiệt trùng: Đóng van S1, S2, AI2. ST2, S4
Làm mát nồi lên men
- Điều chỉnh áp suất hơi ở vỏ nồi về 0.
- Khóa lần lượt các van S7 S6 van xả đáy, van lấy mẫu S5, W11, A1 S103 van 1, 2,3 - Mở van AI2 trên màn hình
- Mở van W7(tay) hoặc WS1(màn hình) Mở van W4 Mở van cấp nước thường W1, W3. Mở van CW1 (bơm nước làm mát).
- Trên màn hình hiển thị ấn Start → No→ Confirm (tiếng Trung Quốc) bên trái màn hình.
- Vào cửa sổ Temp ấn Auto/Manual→ màu xanh - Vào cửa sổ Agit bật cánh khuấy On → màu xanh.
- Van A1 mởMở W7, W11Mở W1, W3.
Nồi lên men được hạ nhiệt độ đến mức yêu cầu.
Tiệt trùng van lấy mẫu
- Mở nhỏ van lấy mẫuMở S6 - Tiệt trùng 30 phút
Van lấy mẫu được tiệt trùng hoàn toàn
Làm khô lọc khí
- Mở các van 1, 2, 3 - Mở FO1 trên màn hình - Mở áp kế
- Sau 5- 15 phút đóng lại
Lọc khí được làm khô, đảm bảo được hiệu suất lọc khí theo yêu cầu.
Tiệt trùng van màng
Khi áp suất hơi đạt P = 0.12 Mpa , nhiệt độ đạt 121oC:
- Mở 2 van màng, mở nhỏ van xả tay - Tiệt trùng 15 phút
Van màng được tiệt trùng hoàn toàn.
Tiệt trùng bình ngưng
- Đóng A3
- Mở van cấp nước ẵ bỡnh( mặt kớnh) - Đóng S11(van màng bình ngưng) - Mở A3, S3, F01Đóng AI2
- Giữ áp suất P = 0.1Mpa, thời gian 20 phút
- Mở van 2, A3. Khí P=0.2 mpa thì Đóng A3, đóng van 2.
Bình ngưng hoàn toàn vô trùng.
38 Giữ và xả áp
suất trong nồi lên men
- Giữ áp suất trong nồi:
+ Đóng van A1, A2
+ Mở AI1, AI2, van áp kế cho khí vào nồi đến áp lực cần ( xem áp lực đồng hồ ..).
- Xả áp suất:
+ Đóng van AI2, van áp kế + Mở A1, A2
Áp suất trong nồi được giữ ở mức yêu cầu.
4. Pha môi trường Pha chế môi trường
- Thành phần môi trường BS1, M4, NaOH 1N đã được chuẩn bị sẵn. Đổ dịch môi trường vào nồi lên men qua cửa cấp chủng.
- Bổ sung thể tích nước RO cho vừa đủ 200 lít.
- Đóng van cửa cấp chủng.
Thu được hỗn hợp môi trường dinh dưỡng phù hợp với việc tăng sinh và tạo bào tử của chủng giống
5. Tiệt trùng môi trường Vận hành tiệt
trùng
Các bước tiệt trùng và làm mát được tiến hành như khi tiệt trùng thiết bị chỉ khác về một số qui định sau:
- Nhiệt độ tiệt trùng: 121 oC/20 phút.
- Thời gian làm khô cột lọc 01, 02 không nhỏ hơn 15 phút.
Môi trường nuôi cấy được tiệt trùng và đảm bảo chất lượng môi trường không bị biến tính.
6. Cấp giống
39 Cấp giống vào
nồi lên men
- Sau khi môi trường đã được tiệt trùng, làm nguội về nhiệt độ nuôi cấy, thì tiến hành cấp chủng giống:
+ Cấp khí vào nồi 2-3 L/phút để tạo áp suất dương.
+ Đốt vòng lửa đèn cồn đưa vào cửa cấp giống, phải duy trì ngọn lửa trong suốt quá trình cấp chủng. Đeo găng tay chuyên dụng để bảo vệ khi thao tác.
+ Mở nắp cửa cấp chủng từ từ để không làm tắt ngọn lửa.
+ Rót hết lượng dịch men đã được định lượng vào nồi.
+ Lần lượt rót môi trường M1, M2, M3 đã chuẩn bị sẵn.
+ Đóng nắp cửa cấp chủng thật chặt.
+ Dập tắt ngọn lửa bằng khăn ướt sạch.
Môi trường được cấp giống thuần khiết, không bị tạp nhiễm.
7. Theo dõi thông số Theo dõi và điều chỉnh các thông số lên men
- Cài đặt auto các thông số nhiệt độ, Air, Agit, theo quy trình công nghệ
- Bật auto bơm Foam
- Nhiệt độ lên men yêu cầu được duy trì ở giá trị 370C.
- Lưu lượng khí (Air): điều chỉnh tốc độ khuấy, lưu lượng khí phù hợp để giá trị DO duy trì giá trị trên 20%.
- Áp suất trong nồi (Press/Mpa): Duy trì giá trị trong khoảng 0.01 đến 0.025 Mpa.
Các thông số lên men được theo dõi và điều chỉnh đáp ứng được quá trình sinh trưởng phát triển trong từng giai đoạn của vi sinh vật.
40 8. Kết thúc
Dựa vào kết quả kiểm tra OD và soi hiển vi
- Khi đã đủ thời gian theo quy định, tiến hành lấy mẫu kiểm tra:
+ Kiểm tra tại chỗ: Soi kính hiển vi xem bào tử đã hình thành, phát triển và phân tách đạt tỉ lệ 95-100% thì tiến hành dừng lên men.
+ Kiểm tra nhiễm: Mẫu lên men được cấy kiểm tra nhiễm, kết quả được ghi chép trong
“Phiếu kết quả thử nghiệm”.
+ Kiểm tra mật độ vi sinh vật: ≥ 2x109 cfu/ml.
- Hoàn thiện Hồ sơ giai đoạn Lên men, sổ sách liên quan và chuyển về Trưởng bộ phận sản xuất
Thu được dịch lên men có mật độ bào tử ≥2x109 cfu/ml, không bị tạp nhiễm Các hồ sơ biểu mẫu được ghi chép đầy đủ.
Ghi chú: Kí hiệu hệ thống Van của nồi lên men được đính kèm phụ lục 1 d) Biểu mẫu hồ sơ giám sát
TT Kí hiệu Tên hồ sơ Thời gian lưu Nơi lưu
1 BM-LM-03.01 Hồ sơ sản xuất công đoạn lên men
3 năm Phòng QA
2 BM-QC-01.01 Phiếu kết quả thử nghiệm 3 năm Phòng QA
GMP.1.3: Lọc tiếp tuyến a) Mục đích
Mục đích của công đoạn lọc là cô đặc dịch lên men để chuẩn bị cho bước sấy phun. Cuối công đoạn lọc thu được dịch đặc chứa chủng vi sinh vật.
b) Phân công trách nhiệm
- Trưởng bộ phận sản xuất có trách nhiệm phân công nhân viên thực hiện công đoạn lọc tiếp tuyến, đảm bảo sự có mặt của nhân viên trong suốt quá trình lọc.
- Nhân viên bộ phận sản xuất có trách nhiệm tuân thủ theo GMP này.
- Bộ phận QC kiểm tra nguyên liệu theo đúng GMP.1.6- “Bảng chỉ tiêu chất lượng áp dụng cho sản phẩm Bacillus subtilis- GMP.1”
41 c) Các thủ tục cần tuân thủ
Các thủ tục cần thực hiện trong GMP.1.4 Lọc tiếp tuyến và mô tả chi tiết các thủ tục theo bảng sau:
Bảng 3.10: Bảng mô tả các thủ tục cần thuân thủ trong công đoạn lọc cho cho sản phẩm Bacillus subtilis- GMP.1
Đầu vào Nội dung chi tiết Kết quả cần đạt đƣợc
5.1. Chuẩn bị Trang thiết bị và nguồn cấp
- Máy bơm Lobe LH44 - Biến tần Jabsco
- Cột lọc tiếp tuyến KrosFlo 2.55m2, 0.02 àm - Hệ giá cột lọc, van, clamp.
- Ống silicol #82, #36 - Nguồn điện 220V, 50Hz
Trang thiết bị và nguồn điện sẵn sàng
Thao tác thực hiện
- Lắp cột lọc lên giá đỡ - Cố định đầu vào với bơm
- Cố định đầu ra sản phẩm, đầu xả thải với ống mềm - Lắp các đồng hồ đo áp suất đầu vào, đầu ra, đầu xả
thải.
- Vặn chặt các clamp.
- Cắm phích điện vào ổ điện.
Hệ thống lọc sẵn sàng
5.2. Vận hành Thao tác vận hành
- Mở van cấp dịch lọc (van xả đáy nồi lên men).
- Mở van đầu ra cột lọc.
- Mở nguồn điện: Bấm công tắc về (ON) trên biến tần - Nhấn RUN, bơm cấp lọc bắt đầu hoạt động.
- Kiểm tra chiều quay của bơm (theo chiều mũi tên trên bơm).
- Vặn Volumn điều chỉnh tần số từ 5 - 20Hz.
Hệ thống lọc khởi động bình thường.
42 5.3. Theo dõi thông số
Theo dõi: - Kiểm tra áp suất đầu vào cột lọc: 6- 8 psi - Kiểm tra áp suất đầu ra dịch lọc: 5- 6 psi - Kiểm tra áp suất dịch thải:1-1.5 psi - Nhiệt độ đầu vào: 120oC
- Nhiệt độ đầu ra: 63- 65oC
Các thông số duy trì và điều chỉnh phù hợp theo từng giai đoạn.
5.4. Kết thúc
Thao tác: - Thể tích dịch lên men sau lọc còn lại 10-12 lít thì kết thúc công đoạn lọc.
- Lấy mẫu QC giai đoạn lọc.
- Giảm tần số về 5Hz - Kết thúc: Nhấn STOP
- Rửa và bảo quản cột lọc “Hướng dẫn rửa và bảo quản cột lọc” .
- Hoàn tất hồ sơ giai đoạn lọc và chuyển về Trưởng bộ phận sản xuất.
Thu được dịch lọc đạt mật độ ≥ 1.0x1010 cfu/ml,
Đảm bảo không tạp nhiễm.
Các hồ sơ biểu mẫu được ghi chép đầy đủ.
d) Biểu mẫu giám sát
STT Kí hiệu Tên hồ sơ Thời gian
lưu
Nơi lưu
1 BM-L-01.01 Hồ sơ sản xuất công đoạn lọc
3 năm Phòng QA
2 BM-QC-
01.01
Phiếu kết quả thử nghiệm 3 năm Phòng QA
GMP.1.4: Sấy phun a) Mục đích
43
Sấy là quá trình tách nước ra khỏi dịch sau lọc bằng sự tác động của nhiệt. Mục đích của quá trình sấy là làm khô dịch lọc và thu hồi khối lượng vi sinh vật về dạng mong muốn để bảo quản, sử dụng và tạo thuận lợi trong quá trình vận chuyển.
b) Phân công trách nhiệm
- Trưởng bộ phận sản xuất có trách nhiệm phân công nhân viên thực hiện công đoạn sấy phun, đảm bảo sự có mặt của nhân viên trong suốt quá trình này.
- Nhân viên bộ phận sản xuất có trách nhiệm tuân thủ theo GMP này.
- Bộ phận QC kiểm tra nguyên liệu theo đúng GMP.1.6- “Bảng chỉ tiêu chất lượng áp dụng cho sản phẩm Bacillus subtilis- GMP.1”
c) Các thủ tục cần tuân thủ
Các thủ tục cần thực hiện trong GMP.1.5 Sấy phun và mô tả chi tiết các thủ tục đó theo bảng sau:
Bảng 3.11: Bảng mô tả các thủ tục cần thuân thủ trong công đoạn sấy phun cho cho sản phẩm Bacillus subtilis- GMP.1
Đầu vào Nội dung chi tiết Kết quả cần đạt đƣợc
1. Kiểm tra điều kiện hoạt động của thiết bị sấy phun Kiểm tra nguồn
cấp
- Nguồn điện 3 pha 380V tại tủ điện - Khí nén ổn định 0.6 – 0.7 Mpa
Các nguồn cấp bình thường.
Thao tác - Lắp đặt hệ đường ống thu hồi sản phẩm và thoát khí.
- Kết nối đường cấp dịch từ tank khuấy tới máy sấy phun.