Chương 3. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.3. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm 1: Khảo sát mật độ của LAB trong quá trình lên men nem chua truyền thống
Mục đích: Quan sát sự phát triển của LAB trong từng này lên men, nhận xét về ưu thế của LAB trong nền mẫu nem chua.
Phương pháp thực hiện
Mẫu nem chua thu nhận tại các thời điểm từ ngày 0 đến ngày 4 được định lượng LAB và tổng vi sinh vật hiếu khí (TVSVHK).
Định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí theo ISO 4833-2:2003
Định lượng LAB theo hướng dẫn của Nguyen (2010) [1].
Thí nghiệm 2: Phân lập vi khuẩn lactic từ nem chua
Mục đích: Phân lập được chủng vi khuẩn lactic điển hình có vai trò chủ đạo trong quá trình lên men. Xác định kiểu lên men của LAB là lên men đồng hình, thích hợp để ứng dụng làm chủng khởi động.
Phương pháp thực hiện
Mẫu nem chua thu nhận tại các thời điểm từ ngày 0 đến ngày 4 đem đi phân lập LAB theo phương pháp của Nguyen, 2010 [1].
- 10 gam mẫu cân vào túi vô trùng, bổ sung 90ml MRS broth, đồng hóa mẫu bằng máy dập mẫu, sau đó đem đi ủ ở 30oC trong 24h.
- Hút 0.1ml dịch tăng sinh lên đĩa MRS agar có bổ sung 1% CaCO3, trải đều dịch lên bề mặt thạch, ủ kị khí ở 30oC trong 48h.
- Chọn khuẩn lạc đặc trưng trên đĩa MRS agar, làm thuần bằng cách cấy ria trên đĩa MRS agar có bổ sung 1% CaCO3 một hoặc nhiều lần.
- Các khuẩn lạc nghi ngờ là LAB có chung các đặc điểm sau: 1-4 mm, màu trắng hoặc kem, hơi lồi, tròn đều và có vòng phân giải với CaCO3. Kiểm thử nghiệm
34
catalase, oxidase và nhuộm gram đối với các khuẩn lạc này. LAB là vi khuẩn gram dương, catalase âm tính và oxidase âm tính.
- Xác định kiểu lên men: Sau khi thu nhận được các LAB thuần, tiến hành thực hiện thí nghiệm xác định kiểu lên men theo hướng dẫn của Nguyễn (2013) [43]: cho ống Durham vào ống nghiệm chứa 10ml MRS broth, tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút, để nguội. Cấy chủng LAB cần thử nghiệm vào ống nghiệm trên, ủ 300C trong 24h. Nếu ống Durham có chưa khí chứng tỏ LAB có sinh khí CO2 (lên men lactic dị hình), nếu ống Durham không có chứa khí chứng tỏ LAB không sinh khí CO2 (lên men lactic đồng hình).
Thí nghiệm 3: Xác định hoạt tính kháng khuẩn
Mục đích: Xác định hoạt tính kháng khuẩn của chủng phân lập được qua các trạng thái sau:
(1) Chủng vi sinh vật sống.
(2) Dung dịch loại bỏ tế bào ( loại bỏ tế bào vi sinh vật sống, dung dịch còn lại chứa acid, H2O2 và bacteriocin).
(3) Dung dịch trung hòa ( trung hòa acid và loại bỏ H2O2, dung dịch còn lại chứa bacteriocin).
Chủng chỉ thị: Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Staphylococcus aureus ATCC 6538
Cách thực hiện:
Tạo dung dịch chủng vi sinh vật sống, dung dịch loại bỏ tế bào và dung dịch trung hòa theo hướng dẫn của Arici(2004) [44]:
Sử dụng dung dịch LAB sau khi đã hoạt hóa. Cấy 1ml dung dịch LAB vào 3 ống, mỗi ống chứa 10ml MRS broth, ủ 30oC trong 24h.
35
- Ống nghiệm 1: Chứa dung dịch LAB đã tăng sinh trong MRS broth. Tiến hành thí nghiệm xác định hoạt tính kháng khuẩn của vi sinh vật sống.
- Ống nghiệm 2: Loại bỏ tế bào: ly tâm 6000 vòng trong 15 phút, thu dịch nổi, lọc qua màng lọc Cellulose Acetate Syringe Filters 0.22 àm.
- Ống nghiệm 3: Sau khi loại tế bào giống như thao tác của ống nghiệm 2, tiến hành trung hòa bằng NaOH 1N tới pH 6.5 và loại bỏ H2O2 bằng cách thêm catalase (5mg/ml).
Xác định hoạt tính kháng khuẩn
Xác định hoạt tính kháng khuẩn của dung dịch chủng vi sinh vật sống bằng phương pháp chấm điểm đĩa thạch (agar spot test) [45] đối với ống nghiệm 1.
- Chuẩn bị đĩa thạch TSA-0.2 (tryptic soy agar +0.2% glucose).
- Nhỏ 1 giọt dung dịch LAB lên bề mặt đĩa, ủ kị khí 30oC trong 24h.
- Phủ kín bề mặt thạch bởi 7ml solfTSA (tryptic soy broth +0.5% agar) chứa 0.7ml huyền dịch chủng chỉ thị có nồng độ 107 CFU/ml , ủ 30oC trong 24h.
- Hoạt tính kháng khuẩn được biểu thị bằng vòng kháng khuẩn xuất hiện xung quanh vết cấy, đo đường kính vòng kháng khuẩn để so sánh hoạt tính kháng khuẩn giữa các chủng LAB.
- Đường kính vòng kháng khuẩn = D - d.Với D: đường kính vòng ức chế xung quanh vết cấy, d: đường kính vết cấy.
Xác định hoạt tính kháng khuẩn của dung dịch loại bỏ tế bào bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch (well diffusion assay) [44] đối với ống nghiệm 2.
- Cấy 0.1ml chủng chỉ thị có nồng độ 107 CFU/ml vào 20ml solfTSA, đổ đĩa, đợi đông.
- Sử dụng ống đục lỗ thạch vô trùng có đường kình 7mm đục lỗ trên đĩa thạch.
- Hỳt 100àl dịch trong ống nghiệm 2 vào lỗ thạch.
36 - Ủ 300C trong 24h
- Đo đường kính vòng kháng khuẩn tương tự như đối với phương pháp chấm điểm đĩa thạch, với d: đường kính lỗ thạch.
Xác định hoạt tính kháng khuẩn của dung dịch trung hòa đối với ống nghiệm 3.
Phương pháp thực hiện tương tự như phương pháp khuếch tán đĩa thạch (well diffusion assay) đối với ống nghiệm 2.
Thí nghiệm 4: Xác định hoạt tính kháng mốc
Mục đích: xác định hoạt tính kháng mốc của chủng LAB phân lập.
Chủng chỉ thị: Aspergillus niger ATCC 16888.
Cách thực hiện: Xác định hoạt tính kháng mốc bằng phương pháp phủ đĩa thạch (dual culture overlay) [10]:
- Chuẩn bị đĩa petry chứa 20 ml MRS agar.
- Cấy 2 vạch chủng LAB, mỗi vạch 2 cm lên bề mặt thạch.
- Ủ 300C trong 24h
- Phủ kín bề mặt thạch bởi 10ml malt extract solf agar (0.05% malt extract+1% agar) chứa 1ml dịch bào tử mốc nồng độ 105 bào tử/ml.
- Ủ 300C trong 48h.
- Xác định diện tích ức chế nấm mốc. Sự ức chế được phân loại bằng cách đo tỉ lệ diện tích tăng trưởng bị ức chế trên tổng diện tích của đĩa petri.
Thang đo sau đây đã được sử dụng: (-) không có sự ức chế có thể nhìn thấy; (+) không có sự phát triển của nấm trên 0,1% - 3% diện tích đĩa; (++) không có sự phát triển của nấm trên 3 - 8% diện tích đĩa; (+++) không có sự phát triển của nấm > 8% diện tích đĩa [26].
37
Thí nghiệm 5. Xác định khả năng sinh acid lactic và giảm pH
Mục đích: Xác định khả năng sinh acid lactic mạnh hay yếu của LAB, chọn ra chủng LAB sinh acid lacic mạnh nhất, làm giảm pH nhanh nhất.
Cách thực hiện:
- Chuẩn bị môi trường MRS broth có nống độ đường D-glucose là 20mg/ml và điều chỉnh pH dung dịch ở 6.5.
- LAB cấy vào 40ml MRS broth, ủ 30oC trong 24h.
- Sau khi ủ, dung dịch tăng sinh mang đi ly tâm tách tế bào: ly tâm 6000 vòng trong 15 phút.
- Dung dịch sau ly tâm được đem đi đo pH trực tiếp bằng máy đo pH theo phương pháp AOAC 943.02 (2012) và đồng thời chuẩn độ bằng NaOH 0.1N theo tiêu chuẩn AOAC 935.57 (2012). Kết quả chuẩn độ NaOH quy về acid lactic.
Thí nghiệm 6 . Định danh LAB
Sau khi xác định hoạt tính kháng khuẩn và kháng mốc của chủng LAB phân lập được, chọn chủng LAB có hoạt tính tối ưu tiến hành định danh bằng phương pháp sinh học phân tử giải trình từ gen bằng 16S rRNA. Gửi mẫu phân tích tại Công ty TNHH Dịch vụ và Thương mại Nam Khoa.
Phương pháp thực hiện:
- Tách chiết DNA.
- Thực hiện PCR với mồi đặc hiệu vùng 16S rRNA
- Giải trình tự trực tiếp rồi so sánh trình tự với ngân hàng dữ liệu NCBI, từ đó xác định mẫu vi khuẩn thuộc loài nào
Thí nghiệm 7. Ứng dụng LAB làm chủng khởi động cho nem chua, so sánh nem chua cấy chủng khởi động và nem chua không cấy chủng khởi động
Mục đích: sử dụng chủng LAB đã phân lập có hoạt tính kháng khuẩn, kháng mốc và khả năng tạo acid lactic và giảm pH tốt nhất ứng dụng lại vào sản xuất nem chua
38
làm chủng khởi động, từ đó so sánh chất lượng của nem chua có bổ sung chủng khởi động và nem chua không cấy chủng khởi động, xác định được ưu thế của chủng khởi động.
Cách thực hiện: Từ kết quả của các thí nghiệm trên, chọn được 2 chủng LAB A và P. Chọn tỷ lệ bổ sung cho 2 chủng LAB là 1:1. Cấy chủng khởi động vào sản phẩm nem chua sao cho sản phẩm có nồng độ chủng khởi động là 107 CFU/g [31].
Sản xuất sản phẩm nem chua có cấy chủng khởi động và nem chua không cấy chủng khởi động. So sánh giữa 2 sản phẩm để khẳng định vai trò của LAB trong việc cải thiện quy trình sản xuất và chất lượng an toàn vệ sinh thực phẩm.
Các chỉ tiêu cần xác định:
Chỉ tiêu hóa lý:
- Chỉ số pH theo AOAC 943.02 (2012)
- Định lượng acid lactic theo AOAC 935.12 (2012)
- Định lượng đường tổng tham khảo theo TCVN 4594:1998 Chỉ tiêu vi sinh:
- Định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí theo ISO 4833-2:2003 - Định lượng E. coli theo ISO 16649-2:2001
- Định lượng Staphylococcus aureus theo ISO 6888-1:1999 - Định lượng tổng số nấm mốc theo ISO 21527-1:2008 - Định tính Salmonella spp. theo ISO 6579-1:2017
- Định lượng LAB theo hướng dẫn của Nguyen (2010)[1].