Chương 4. Kết quả và bàn luận
4.2. Phân lập LAB từ nem chua
Phân lập LAB từ mẫu nem chua truyền thống trên môi trường đĩa thạch MRS+1%
CaCO3, thu nhận được tổng cộng có 18 dạng khuẩn lạc khác nhau có các đặc điểm của vi khuẩn lactic như sau: 1-4mm, màu trắng hoặc kem, hơi lồi, tròn đều và có vòng phân giải với CaCO3. Các khuẩn lạc được ký hiệu A, B, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, U, S.
18 khuẩn lạc này khi thu nhận ở mỗi ngày lên men có sự đa dạng khác nhau. Ở ngày 0 lên men, kết quả phân lập thấy có sự xuất hiện của 4 khuẩn lạc A, B, C, D.
Trong ngày l lên men có sự xuất hiện của A, B, C, D, E, F, G. Trong ngày lên men 2, 3 và 4, có sự xuất hiện của cả 18 khuẩn lạc từ A tới T. Sự đa dạng của LAB cũng phản ánh khả năng thích nghi của LAB trong nền mẫu thịt lên men. Ngày 0 lên men chỉ phát hiện 4 khuẩn lạc nghi ngờ là LAB, nhưng số lượng khuẩn lạc LAB tăng lên 7 vào ngày 1 và lên 18 vào các ngày tiếp theo. Ngày 0 là sản phẩm ngay thời điểm bắt đầu lên men, tức là đại diện cho LAB trong nguyên liệu sản xuất, lúc này, LAB xuất hiện
47
trong nguyên liệu rất ít, chỉ có 4 chủng chiếm ưu thế và 4 chủng này phát triển mạnh nên được phát hiện trong quá trình phân lập, các chủng còn lại không phát hiện không có nghĩa là nó không có mặt trong nền mẫu, mà lúc này, số lượng của nó không chiếm ưu thế mà chỉ có số lượng rất thấp, không thể phát hiện trong quá trình phân lập. Sau thời gian lên men, các LAB phát triển nhanh chóng và dần tăng số lượng, cho kết quả phân lập được, nền mẫu thịt lên men đã cung cấp điều kiện thích hợp cho sự phát triển của LAB.
18 khuẩn lạc này tiếp tục được kiểm tra catalase, oxidase và nhuộm gram:
Thử nghiệm Catalase với tác nhân là H2O2 3% với tất cả 18 khuẩn lạc đã thu nhận, cho thấy kết quả âm tính (không tạo thành khí) đối với 13 khuẩn lạc và dương tính (có tạo bọt khí) đối với 5 khuẩn lạc ( F, M, Q, R, S)
Thử nghiệm Oxidase 13 khuẩn lạc phân lập bằng que thử oxidase (Oxidase test strips), kết quả cho thấy 13 khuẩn lạc này hiển thị màu vàng trên Oxidase test strips, cho kết quả âm tính.
Trong 13 mẫu phân lập được tiến hành nhuộm gram, có 11 chủng phân lập có màu xanh đậm của phức hợp tím-iốt để chúng được kết luận là vi khuẩn Gram (+), có 9 mẫu có hình thái tế bào dạng hình que, nối đôi hoặc chuỗi, 2 mẫu dạng song cầu hoặc tứ cầu. 2 mẫu phân lập I và U cho kết quả gram âm (tế bào bắt màu hồng khi nhuộm gram).
Sau khi thực hiện tất cả các thử nghiệm trên, kết luận thu nhận được 11 chủng có các đặc điểm sinh hóa catalase âm tính, oxidase âm tính và gram dương, các chủng này được xác định là LAB.
Xác định LAB lên men đồng hình hay dị hình rất quan trọng trong việc lựa chọn chủng khởi động. Buckenhiiskes (1993) chỉ ra rẳng LAB lên men dị hình không thích hợp làm chủng khởi đầu cho quá trình lên men xúc xích vì nồng độ acid acetic cao tạo ra mùi vị hăng khó chịu. Ngoài ra, việc tạo ra lượng lớn CO2 dẫn đến sự hình thành của
48
các lỗ có kích cỡ khác nhau trong sản phẩm [48]. LAB được thử nghiệm để xác định kiểu lên men nhờ khả năng tạo CO2. LAB nuôi cấy trong ống nghiệm MRS broth chứa ống Durham. Sau 24h ủ ở 30oC, tất cả 11 chủng LAB đều không sinh khí trong ống Durham, cho thấy 11 chủng này đều lên men đồng hình.
Vì là chủng LAB lên men đồng hình, nên trong quá trình trao đổi chất chuyển hóa năng lượng, sản phẩm mà nó tạo ra chủ yếu là acid lactic. Ngoài ra, LAB sở hữu một số flavoprotein oxydases nhưng thiếu enzyme catalase, chúng tạo ra H2O2 với sự hiện diện của oxy. Bacteriocin là sản phẩm được tổng hợp nhờ ribosome của LAB.
Các khuẩn lạc được xác định là LAB được kí hiệu, mô tả hình dạng khuẩn lạc, hình thái tế bào và đặc điểm sinh hóa như trong bảng 4.2 và hình 4.1.
Bảng 4.2. Đặc điểm hình dạng khuẩn lạc và hình thái tế bào LAB Kí
hiệu Hình dạng khuẩn lạc Hình thái tế bào dưới
kính hiển vi Catalase Oxidase
Sinh khí (CO2) A Trắng sữa, 1-2mm, lồi
nhiều, nhẵn bóng
Hình que, thon dài, nối
đôi - - -
B Trắng sữa đục, 2mm, lồi, viền đều
Hình cầu, nối đôi hoặc
tứ cầu - - -
C
Trắng ngà, 1mm, viền đều, khuẩn lạc hơi
trong
Hình que, rất ngắn, nối
đôi - - -
D
Trắng ngà, 1mm, viền đều, khuẩn lạc đục, lồi
nhiều
Hình que, nhỏ, ngắn,
nối đôi - - -
E Trắng ngà, 2mm, lồi Hình que, thon nhỏ và - - -
49 ít, viền đều ngắn, nối đôi G Trắng ngà, đục, 2mm,
viền đều, lồi nhọn
Hình que, ngắn, nối
đôi - - -
H Trắng sữa,1mm, viền trong, lồi hơi nhọn
Hình cầu, nối đôi hoặc
tứ cầu - - -
K Trắng sữa, đục, 2mm
tròn đều, lồi ít Hình que, dài, nối đôi - - -
L Trắng ngà, 3mm, tròn đều, lồi ít
Hình que ngắn dài khác nhau,nối đôi
hoặc đơn
- - -
N
Trắng sữa, bóng, 2mm, viền trong, lồi
nhọn
Hình que dài, đôi hoặc
đơn - - -
P
Trắng sữa đục, 1- 2mm, lồi nhiều, tròn
đều
Hình que, nối đôi hoặc
chuỗi - - -
50
Hình dạng khuẩn lạc Hình thái tế bào
A
B
C
51 D
E
G
52 H
K
L
53 N
P