Chương 4. Kết quả và bàn luận
4.3. Tuyển chọn chủng LAB có khả năng kháng khuẩn
11 chủng vi sinh vật được xác định là LAB được thử nghiệm khả năng kháng khuẩn với 3 chủng vi sinh vật chỉ thị là Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Staphylococcus aureus ATCC 6538.
54
Bảng 4.3. Đường kính vòng kháng khuẩn (mm)
LAB
Dung dịch chủng vi sinh vật sống Dung dịch loại bỏ tế bào Dung dịch trung hòa
E. coli S.
typhimurium S. aureus E. coli S.
typhimurium S. aureus E. coli S.
typhimurium S. aureus A 7.33±0.58f 7.67±0.58 e 8.67±0.58e 17.00±0.00g 15.67±0.58f 22.33±1.15d 6.67±1.15b 3.67±0.58b 6.00±0.00b B 5.33±0.58d 3.00±0.00 c 5.00±0.00d 4.33±0.58cde 4.67±0.58cd 2.33±1.15b - - - C 5.00±0.00d 2.00±0.00 b 3.00±0.00b 5.00±0.00de 5.00±1.00d 3.00±0.00b - - -
D 4.00±0.00c 1.00±0.00 a 2.00±0.00a 2.00±0.00b - - - - -
E 4.00±0.00c 2.00±0.00 b 4.00±0.00 c 4.00±1.00cd 3.67±1.15bc 2.00±0.00b - - -
G 3.00±0.00b 2.00±0.00 b 4.00±0.00c - - - -
H 3.00±0.00b 1.00±0.00 a 3.00±0.00 b 3.33±0.58bc 2.67±0.58b - - - -
K 3.00±0.00b 2.00±0.00 b 4.00±0.00 c 4.67±1.15cde 3.67±0.58bc 2.33±0.58b - - - L 2.00±0.00a 1.00±0.00 a 2.00±0.00 a 5.67±0.58e 2.67±0.58b 3.00±0.00b - - - N 3.00±0.00b 3.00±0.00 c 4.00±0.00 c 3.67±1.15cd 4.00±0.00cd 2.00±0.00b - - - P 6.67±0.58e 5.33±0.58 d 9.67±0.58f 13.33±1.53f 10.33±1.53e 16.00±2.00c 8.67±1.15c 6.67±0.58c 6.00±0.00b
a-f: Các giá trị có kí tự khác nhau trong cùng một cột thì khác nhau có ý nghĩa thống kê (p < 0.05) - : không có hoạt tính kháng khuẩn
55
Hình 4.2. Hoạt tính kháng khuẩn của chủng vi sinh vật sống bằng phương pháp chấm điểm đĩa thạch
Hình 4.3. Hoạt tính kháng khuẩn của dung dịch loại bỏ tế bào bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch
0 2 4 6 8 10 12
A B C D E G H K L N P
Đƣờng kính vòng kháng khuẩn (mm)
Chủng LAB
E.coli
Salmonella typhimurium Staphylococcus aureus
0 5 10 15 20 25
A B C D E G H K L N P
Đƣờng kính vòng kháng khuẩn (mm)
Chủng LAB
E.coli
Salmonella typhimurium Staphylococcus aureus
56
Hình 4.4. Hoạt tính kháng khuẩn của dung dịch trung hòa bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch
a. Xác định hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp chấm điểm đĩa thạch (agar spot test) đối với dung dịch tế bào sống.
Phương pháp chấm điểm đĩa thạch được sử dụng để thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của chủng vi sinh vật sống với 3 chủng chỉ thị là Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Staphylococcus aureus ATCC 6538. Kết quả thể hiện qua đường kính vòng kháng khuẩn đo được. Phương pháp này cho thấy khả năng kháng trực tiếp của LAB với các chủng chỉ thị, tất cả 11 chủng LAB đều có hoạt tính kháng trực tiếp với cả 3 vi khuẩn chỉ thị ở những mức độ khác nhau (từ 1mm đến 9.67 mm), trong đó hoạt tính cao nhất là của chủng A và P.
Trong các vi sinh vật gây ô nhiễm thực phẩm và gây bệnh cho người, E. coli, S.
typhimurium là 2 chủng vi sinh vật đại diện cho nhóm vi khuẩn gram âm, S. aureus đại diện cho nhóm vi khuẩn gram dương. Bảng 4.3 và hình 4.2 cho thấy A và P có mức độ ức chế S. aureus cao nhất (8.67mm và 9.67mm), mức độ ức chế E. coli và S.
typhimurium thấp hơn ( A và P lần lượt là 7.33mm và 6.67 mm đối với E. coli, 7.67mm
0 5 10 15 20 25
A B C D E G H K L N P
Đƣờng kính vòng kháng khuẩn (mm)
Chủng LAB
E.coli
Salmonella typhimurium Staphylococcus aureus
57
và 5.33 với S. typhimurium). Theo Awaisheh và cộng sự (2009), LAB phân lập từ các sản phẩm thịt đóng gói chân không ăn liền có mức độ ức chế với S. aureus cao hơn so với E. coli và S. typhimurium cả trong môi trường thí nghiệm hiếu khí và kị khí (S.
aureus: 22–26 mm trong điều kiện hiếu khí và 16–18 mm trong điều kiện kị khí; E.
coli: 16-18mm trong điều khiện hiếu khí và 1-14mm trong điều kiện kị khí; S.
typhimurium: 15-16mm trong điều kiện hiếu khí và 12-13mm trong điều kiện kị khí) [49]. Tuy nhiên, khả năng ức chế vi sinh vật gram âm và dương lại không có quy luật chung ở tất cả các LAB phân lập từ các môi trường khác nhau. Hwanhlem và cộng sự (2011) phân lập LAB từ sản phẩm Plasom, một sản phẩm cá lên men của Thái Lan, cho kết quả 14 chủng LAB phân lập được có khả năng ức chế Salmonella sp. cao hơn so với S. aureus, và trong 14 chủng này chỉ có 7 chủng ức chế được E. coli [5].
b. Xác định hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch (well diffusion assay) đối với dung dịch loại bỏ tế bào.
Hoạt tính kháng khuẩn được thử nghiệm qua phương pháp khuếch tán đĩa thạch đối với dung dịch loại bỏ tế bào. Dung dịch loại bỏ tế bào giúp đánh giá chung về hoạt tính kháng khuẩn của các sản phẩm LAB tạo ra trong quá trình lên men như acid hữu cơ, H2O2 và bacteriocin.
Kết quả được trình bày ở bảng 4.3 và hình 4.3. Ở thí nghiệm với dung dịch loại bỏ tế bào, trong 11 chủng LAB, chỉ có 8 chủng kháng lại cả 3 vi sinh vật chỉ thị, chủng H chỉ kháng được vi khuẩn gram âm là E. coli và S. typhimurium, chủng D chỉ kháng được E. coli và chủng G không thể hiện hoạt tính kháng khuẩn. 3 chủng D, G, H khi thử nghiệm với phương pháp chấm điểm đĩa thạch cho kết quả ức chế với cả 3 chủng chỉ thị, trong khi thử nghiệm với phương pháp khuếch tán đĩa thạch, hoạt tính của 3 chủng này đã bị thay đổi. Schillinger và Lücke (1989) đã thu được kết quả tương tự khi kiểm tra các chủng Lactobacillus sake dương tính trong thử nghiệm chấm điểm đĩa thạch và âm tính trong thử nghiệm khuếch tán đĩa thạch: trong tổng số 19 chủng thể hiện vùng ức chế trên phương pháp chấm điểm đĩa thạch, chỉ có sáu chủng có vùng ức
58
chế được tạo ra trên môi trường thạch trong phương pháp khuếch tán đĩa thạch [50].
Lewus và cộng sự. (1991) cũng nhận thấy rằng chỉ một số chủng đã được thử nghiệm dương tính bằng phương pháp chấm điểm đĩa thạch cho kết quả dương tính trong phương pháp khuếch tán đĩa thạch [51]. Vấn đề này được giải thích do các hợp chất tạo ra bởi LAB không thể khuếch tán vào đĩa thạch, do sự bất hoạt protease hoặc tác dụng tập trung của các hợp chất này, tất cả có thể dẫn đến kết quả âm tính giả trong phương pháp khuếch tán đĩa thạch. Giải pháp đưa ra là cho phép một thời gian để các hợp chất khuếch tán vào môi trường thạch trước khi ủ hoặc tăng kích thước giếng để có thể áp dụng nhiều mẫu hơn, có thể làm tăng độ nhạy của phương pháp. Tuy nhiên, cũng có một hướng giải thích khác là do vai trò đối kháng trực tiếp của các tế bào sống LAB đã được thể hiện trong phương pháp chấm điểm đĩa thạch, với chủng G khi thử nghiệm chấm điểm đĩa thạch có hoạt tính kháng khuẩn với cả vi khuẩn gram âm và dương, nhưng hoạt tính này biến mất trong phương pháp khuếch tán đĩa thạch, điều này cho thấy, ngoài vai trò của các sản phẩm mà LAB tạo ra như acid lactic, H2O2 và bacteriocin, khả năng đối kháng trực tiếp của LAB với vi khuẩn gây bệnh trong trường hợp này có thể là do cạnh tranh dinh dưỡng [52], phương thức cạnh tranh này đã được nghiên cứu trong vai trò probiotics của LAB [49], [60] nhưng trong vai trò của chủng khởi động thì vẫn còn hạn chế.
Trong những chủng có hoạt tính thì chủng A và P là chủng có hoạt tính cao nhất, 2 chủng này kháng lại vi khuẩn gram dương là S. aureus (22.33mm và 16mm) mạnh hơn so với 2 vi khuẩn gram âm E. coli và S. typhimurium. (A và P lần lượt ở E. coli:
17mm và 13.33mm; S. typhimurium: 15.67mm và 10.33mm). Điều này tương đồng với kết quả của phương pháp chấm điểm đĩa thạch.
Vi khuẩn gram dương có cấu trúc tế bào từ ngoài vào bao gồm: thành tế bào có sự hiện diện của lớp peptidoglycan dày (50-90% thành tế bào), khoảng không chu chất nhỏ (periplasm) và màng tế bào (cell membrane). Vi khuẩn gram âm có lớp peptidoglycan mỏng hơn (10% thành tế bào), nhưng bao bọc bên ngoài có lớp màng
59
ngoài (outer membrane) cấu tạo bởi lipopolysaccharide. Tác dụng kháng khuẩn của acid là do khả năng không liên kết của phân tử acid, giúp xâm nhập màng tế bào chất.
Điều này dẫn đến giảm pH nội bào và sự gián đoạn của động lực proton xuyên màng [5]. Hiệu quả của acid lactic chống lại vi khuẩn gram âm là do phân tử acid lactic nhỏ, hòa tan trong nước có thể xâm nhập vào periplasm thông qua các protein porin chứa đầy nước của màng ngoài. Tuy nhiên, màng ngoài có chức năng như một hàng rào thấm hiệu quả có khả năng loại trừ các đại phân tử (như vi khuẩn hoặc enzyme) và các chất kỵ nước (như kháng sinh kỵ nước), do các phân tử lipopolysaccharide bao gồm một phần lipid, được gọi là lipid A và chuỗi heteropolysacaride ưa nước nhô ra ngoài và cung cấp cho tế bào một bề mặt ưa nước.
c. Xác định hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch (well diffusion assay) đối với dung dịch trung hòa
Dung dịch trung hòa là dung dịch loại bỏ tế bào được trung hòa bằng NaOH về pH 6.5 và loại bỏ H2O2 bằng enzyme catalase. Dung dịch này cho phép xác định hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin tạo ra bởi LAB.
Bảng 4.3 và hình 4.4 cho thấy khi xác định hoạt tính kháng khuẩn của 11 chủng LAB bằng thử nghiệm với dung dịch trung hòa, chỉ có chủng A và P có hoạt tính kháng khuẩn, hoạt tính giảm đáng kể so với 8 chủng kháng khuẩn của dung dịch loại bỏ tế bào. Nghiên cứu của Hwanhlem và cộng sự (2011) chỉ ra rằng khi 4 chủng LAB phân lập được từ sản phẩm Plasom của Thái Lan có hoạt tính kháng khuẩn đối với Escherichia coli, S. aureus và Salmonella sp., khi thử nghiệm với dung dịch loại trung hòa thì tất cả các chủng không thể hiện hoạt tính ức chế [5].
Tác dụng kháng khuẩn của dung dịch trung hòa giảm so với dung dịch loại bỏ tế bào cho thấy vai trò ức chế vi khuẩn gây bệnh chủ yếu là do acid hữu cơ và H2O2. Mức độ và loại acid hữu cơ được tạo ra trong quá trình lên men phụ thuộc vào các loài hoặc chủng LAB, thành phần nuôi cấy và điều kiện sinh trưởng [5]. Hydrogen peroxide
60
được sản xuất bởi LAB với sự hiện diện của oxy là kết quả của hoạt động của flavoprotein oxyase hoặc nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) peroxidase. Tác dụng kháng khuẩn của hydro peroxide là kết quả từ quá trình oxy hóa các nhóm sulfhydryl gây biến tính một số enzyme và từ quá trình oxy hóa lipid màng, do đó làm tăng tính thấm của màng [5, 30]. Tác dụng kháng khuẩn của acid hữu cơ nằm ở việc giảm pH, cũng như dạng không phân chia của các phân tử acid, pH bên ngoài thấp gây ra acid hóa tế bào chất của tế bào, trong khi acid không phân ly, là lipophilic, có thể khuếch tán thụ động qua màng. Acid không phân ly hoạt động bằng cách thu hẹp gradient proton điện hóa hoặc bằng cách thay đổi tính thấm của màng tế bào dẫn đến phá vỡ hệ thống vận chuyển cơ chất [30].
Bacteriocin chỉ được tạo ra ở 2 chủng A và P với hoạt lực khác nhau, nhưng cả 2 loại bacteriocin này đều kháng được cả vi khuẩn gram âm và gram dương. Không phải LAB nào cũng tạo được bacteriocin và mỗi loại bacteriocin chỉ có hoạt tính ức chế đối với một hoặc một số vi khuẩn nhất định. Từ hàng trăm LAB giả định được phân lập từ 46 loại thực phẩm lên men, Elegado và đồng nghiệp (2003) đã tìm thấy 9 chủng phân lập sản xuất ra các bacteriocin hoạt động chống lại Lb. plantarum NCDO 955 [53].
Arici và cộng sự (2004) tìm thấy hoạt tính ức chế của bacteriocin của Lactobacilli chống lại một số chất gây ô nhiễm thực phẩm và vi khuẩn gây bệnh như Escherichia coli, Staphylococcus aureus ATCC 28213, S. aureus ATCC 2392, Yersinia enterica [44]. Pilasombut và cộng sự (2015) phân lập được 150 chủng LAB trong 10 mẫu nem chua nhưng chỉ có 1 chủng KL-1 tạo bacteriocin kháng Lactobacillus sakei, Leuconostoc mesenteroides và Enterococcus faecalis [40].
61
E. coli S. typhimurium S. aureus
(a)
Đối chứng
A
P
(b) Đối chứng
62 A
P
(c) A
P
Hình 4.5. Hoạt tính kháng khuẩn của LAB A và P đối với 3 chủng chỉ thị Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Staphylococcus aureus ATCC 6538 trong: (a) Dung dịch tế bào sống, (b) Dung dịch loại bỏ tế bào, (c) Dung dịch trung hòa.
63