CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.3. Xác định giai đoạn động dục ở chuột nhắt trắng ICR
Có rất nhiều phương pháp dùng để xác định chu kì động dục ở chuột như đo trở kháng điện [36], phân tích sinh hóa nước tiểu [37], quan sát trực quan âm hộ [35], vết phết tế bào âm đạo [20]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện phương pháp quan sát trực quan âm hộ và vết phết tế bào âm đạo. Đây là hai phương pháp đơn giản, dễ thực hiện và có tính chính xác cao [20]. Ngoài ra, hai phương pháp này phù hợp cho việc tiến hành nghiên cứu tiếp theo.
3.2.3.2. Phương pháp quan sát trực quan âm hộ
Phương pháp quan sát trực quan âm hộ là phương pháp dễ thực hiện, ít tốn kém và ít gây tổn hại đến động vật nghiên cứu nhất, vì âm hộ là bộ phận bên ngoài cơ thể. Đây cũng là phương pháp thuận lợi nhất cho việc tiến hành các nghiên cứu tiếp theo mà không làm động vật nghiên cứu trở nên căng thẳng hay hoảng sợ.
Quan sát trực quan âm hộ được tiến hành như sau:
1. Cố định chuột bằng tay trái. Ngón tay trỏ và ngón tay cái của bàn tay trái giữ lấy phần tai và cổ chuột, đồng thời ngón tay út và áp út kẹp lấy đuôi chuột sao cho chuột không quay đầu hay có các cử động mạnh khác.
2. Hướng phần phía bụng và cơ quan sinh dục của chuột về phía người thực hiện. Quan sát và ghi nhận âm hộ chuột theo các chỉ tiêu: màu sắc, hình thái, sự xuất hiện của nếp nhăn, mức độ sưng, độ ẩm ướt và kích thước của âm hộ hay trạng thái đóng hay mở của âm hộ [20], [24], [35].
3. Thả chuột nhẹ nhàng và đưa trở lại buồng nuôi.
Sự thay đổi của âm hộ chuột qua các giai đoạn được thể hiện như hình sau:
Hình 3.4. Bốn giai đoạn của chu kì động dục ở chuột BALB/cByJ thuộc chủng albino [20], [24].
A: Proestrous – tiền động dục. B: Estrous – động dục. C: metestrous – sau động dục. D: Diestrous – nghỉ động dục.
3.2.3.3. Xác định chu kì động dục ở chuột cái bằng vết phết tế bào âm đạo Phương pháp vết tế bào âm đạo có thể tiến hành theo hai cách. Dịch tế bào âm đạo sau khi được cố định trên lam kính, có hai cách để xác định sự hiện diện của các tế bào. Cách thứ nhất là quan sát trực tiếp lam kính [20], [38]; cách thứ hai là nhuộm với các loại thuốc nhuộm trong phương pháp Papanicolaou [38], Crystal violet [22] hoặc thuốc nhuộm xanh methylen [20], [35], [38]. Trong nghiên cứu này của chúng tôi, phương pháp nhuộm xanh methylen 1% trong vòng 45 giây được thực hiện để quan sát sự hiện diện của các loại tế bào âm đạo chuột mang thai và chuột mang thai hộ đồng thời xác định giai đoạn tiền động dục và động dục của chuột. Quá trình xác định các giai đoạn của chu kì động dục bằng vết phết tế bào âm đạo được thực hiện vào lúc 8 – 9 h sáng [39] như sau:
1. Bắt chuột và giữ cố định chuột bằng tay trái sao cho âm hộ chuột hướng về phía người thực hiện để dễ dàng thao tác.
2. Dựng pipet man hỳt 10 àl dung dịch nước muối sinh lý (NaCl 0.9%) , sau đó đưa nhẹ nhàng dung dịch này vào âm đạo chuột không quá 0,5 cm [25] sao cho đầu tuýp của pipet không đụng thành âm đạo chuột. Tiến hành hút, nhả dung
dịch nước muối này trong âm đạo chuột 5-7 lần, sau đó hút ngược trở lại vào pipet man và rút pipet man ra khỏi âm đạo chuột một cách nhẹ nhàng. Trong trường hợp đầu tuýp của pipet man chạm vào thành âm đạo chuột thì phải nhanh chóng thả chuột ra và đưa trở lại buồng nuôi để tránh làm chuột trở nên hoảng sợ và căng thẳng thêm vì khả năng rách âm đạo là rất cao hoặc gây rối loạn sinh lý chuột bởi việc mang thai giả không mong muốn ở chuột.
3. Thu nhận dung dịch nước muối sinh lý chứa dịch âm đạo chuột vào eppendorf 0,2 ml.
4. Dung dịch này được nhuộm với xanh methylen 1% với tỉ lệ 1:1 trong vòng 45 giây [20]. Nhỏ 1 giọt dung dịch này lên lam kính với thể tích cố định là 10 àl, đậy lammel lờn giọt dung dịch sao cho khụng cú bọt khớ, để khụ tự nhiờn và quan sát dưới kính hiển vi quang học.
5. Đối với trường hợp quan sát mẫu tươi mà không nhuộm với thuốc nhuộm đặc trưng, thì sau khi nhỏ giọt lên lam kính, đậy lam kính, để khô tự nhiên hoặc quan sát ngay.
6. Đánh giá sự xuất hiện của các loại tế bào trên tiêu bản và xác định các giai đoạn trong chu kì động dục theo biểu đồ tròn bên dưới.
Sơ đồ 1: Biểu thị cho sự xuất hiện các loại tế bào trong chu kì động dục ở chuột
Hình 3.5. Quá trình thu nhận dịch âm đạo ở chuột [40]
a: Giữ chuột cố định sao cho cơ quan sinh dục chuột cái hướng về phía người thực hiện. b, c: Đưa pipet có chứa NaCl 0,9% và hút nhả dung dịch này vào âm
đạo của chuột, sau đó rút pipet ra khỏi âm hộ chuột.
Hình 3.6. Nhỏ 1 giọt dung dịch có chứa dịch âm đạo chuột lên lam kính được đánh số thứ tự
a, b: Pipet pasteur nhỏ giọt. c: Lam kính được đánh số thứ tự chứa giọt dung dịch âm đạo chuột
Hình 3.7. Sự hiện diện của các tế bào qua các giai đoạn của chu kì động dục được xác định bằng phương pháp vết phết tế bào âm đạo và quan sát ở mẫu tươi [20].
A: Giai đoạn tiền động dục với sự xuất hiện của cả ba loại tế bào với tỉ lệ cao, trong đó mũi tên màu trắng: tế bào biểu mô có nhân. B: Giai đoạn động dục với
sự xuất hiện chủ yếu của tế bào biểu mô sừng hóa (mũi tên màu đen). C: giai đoạn sau động dục được xác định bằng việc bắt đầu xuất hiện các tế bào bạch cầu (vòng tròn màu đen). D: Giai đoạn nghỉ động dục với sự xuất hiện của hầu
hết là tế bào bạch cầu.
Hình 3.8. Sự hiện diện của các tế bào qua các giai đoạn của chu kì động dục được xác định bằng phương pháp vết phết tế bào âm đạo và nhuộm H&E [25].
A: Giai đoạn sau động dục với sự xuất hiện của cả ba loại tế bào với tỉ lệ cao B:
Giai đoạn tiền động dục với sự xuất hiện chủ yếu của tế bào biểu mô có nhân. C:
giai đoạn nghỉ động dục được xác định bằng việc bắt đầu xuất hiện các tế bào bạch cầu D: Giai đoạn động dục với sự xuất hiện của hầu hết là tế bào biểu mô
sừng hóa không nhân.