CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.9. Nuôi phôi và chọn lọc các phôi được chuyển
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phôi được chuyển là phôi giai đoạn 2 tế bào, do đó sau khi vi tiêm DNA vào hợp tử giai đoạn hai tiền nhân, ghi nhận thấy sự phát triển đồng đều của các phôi bào giai đoạn hai tế bào được chúng tôi sử dụng làm nguồn phôi ứng viên (hình 19: mũi tên màu cam) cho quá trình chuyển phôi vào ống dẫn trứng chuột mang thai hộ. Đối với các phôi có số lượng phôi bào, chất lượng các phôi bào không đạt như màng bào tương không tròn đều, các hạt bên trong bào tương không đồng nhất được chúng tôi loại bỏ (hình 19: mũi tên màu xanh)
Hình 3.13. Phôi giai đoạn 2 tế bào phát triển sau quá trình vi tiêm DNA vào tiền nhân đực
Mũi tên xanh: đại diện phôi bất thường về hình dạng các phôi bào. Mũi tên cam:
đại diện các phôi bình thường với chất lượng tốt, có các phôi bào đầy đủ về mặt kích thước và hình dạng). A: Độ phóng đại 4X, B: Độ phóng đại 10X
Chuẩn bị con nhận phôi (chuột mẹ mang thai hộ)
Trong nghiên cứu này, chuột cái mang thai hộ hay còn gọi là chuột nhận phôi (pseudopregnant recipient females). Chuột nhận phôi trưởng thành về mặt sinh
dục, đối với chuột mus musculus var. albino là 8-10 tuần tuổi. Để có thể tạo được chuột cái mang thai giả, chuột cái và chuột đực ghép đôi với nhau cần phải giao phối thành công. Để việc giao phối thành công, tức là chuột cái phải sẵn sàng cho quá trình tiếp nhận giao phối. Đối với sinh lý sinh sản của chuột cái, trong các giai đoạn của chu kì động dục, giai đoạn động dục (estrus) là giai đoạn chuột cái dễ dàng tiếp nhận giao phối nhất, trong khi đó chuột ở giai đoạn metestrus và đặc biệt là diestrus là giai đoạn không sẵn sàng cho quá trình giao phối nhất. Do đó, chúng tôi tiến hành xác định giai đoạn động dục của chuột cái bằng hai phương pháp là quan sát trực quan âm đạo và vết phết tế bào âm đạo. Tuy nhiên, phương pháp vết phết tế bào âm đạo được sử dụng như là một phương pháp đối chiếu với phương pháp quan sát trực quan âm đạo, do đó phương pháp này được chúng tôi sử dụng như là tiền đề để chọn được chuột ở giai đoạn động dục bằng phương pháp không xâm lấn là quan sát trực quan âm đạo. Điều này được nhóm nghiên cứu thực hiện vì quan sát trực quan âm đạo là phương pháp ít gây trạng thái căng thẳng nhất ở chuột, đồng thời tiết kiệm được thời gian và tiền bạc trong quá trình làm nghiên cứu. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi người nghiên cứu phải có bề dày kinh nghiệm để có thể chọn được chuột ở giai đoạn động dục.
Chuột sau khi xác định được giai đoạn động dục sẽ được chọn để phối với chuột đực bất thụ theo tỉ lệ 1:2, trong đó 2 chuột cái và 1 chuột đực bất thụ [45], [26]. Một ngày sau khi ghép cặp (6-12h), chuột cái được kiểm tra nút nhầy âm đạo với sự hiện diện của một nút màu trắng đục hoặc vàng nhạt, chứng tỏ quá trình giao phối đã diễn ra [17], [45].
Chuột sau khi kiểm tra thấy dấu hiệu giao phối thành công sẽ được kiểm tra vị trí nhận phôi bằng phương pháp giải phẫu.
Tùy theo vị trí chuyển phôi mà có các giai đoạn phôi chuyển được lựa chọn.
Bảng 3.1. Xác định các giai đoạn của phôi chuột tiền làm tổ
Hình 3.14. Vị trí của phôi các giai đoạn trong ống dẫn trứng ở chuột [18]
Trong nghiên cứu này, chúng tôi chuyển phôi giai đoạn 2 tế bào, do đó vị trí thích hợp cho việc chuyển phôi là ống dẫn trứng. do đó chuột cái giải phẫu mở lưng và kiểm tra vị trí chuyển phôi. Với các chuột cái có xuất hiện ampulla sẵn sàng cho quá trình chuyển phôi. Phôi giai đoạn 2 tế bào được chia thành các nhóm riêng biệt, mỗi nhóm 10-20 phôi và chuyển vào ống dẫn trứng chuột cái mang thai hộ.
Cấy chuyển phôi vào chuột mẹ mang thai hộ
Chuột mẹ nhận phôi sau khi được kiểm tra vị trí nhận phôi sẽ được tiến hành chuyển phôi theo quy trình của Bita Ghassemi [32]. Quá trình chuyển phôi được mô tả tóm tắt như sau:
Chuột cái được gây mê hoàn toàn, và xử lí với cồn 70% ở xung quanh khu vực lưng, nơi gần nhất với buồng trứng, ống dẫn trứng và tử cung. Lưu ý: lau khô cồn sau khi sát trùng ở vùng lông. Tạo một vết rạch ở vùng da của phía lưng chuột cái, sau đó dùng kéo tách hết các mô liên kết của vùng cơ và vùng da xung quanh, tiếp tục tạo một vết rạch ở lớp cơ sao cho có thể thấy được đệm mỡ sinh dục, dùng kẹp nhỏ nhanh chóng kéo đệm mỡ sinh dục và đoạn buồng trứng, ống dẫn trứng ra ngoài và lót trên gạc vô trùng sao cho không tiếp xúc với lông của chuột. Chuột cái được chuyển lên kính hiển vi soi nổi và tìm vị trí ampulla cho quá trình chuyển phôi. Dùng kéo vi phẫu thuật tạo một lỗ nhỏ ở vị trí trước ampull, sau đó chuyển phôi từ kim chuyển phôi vào ống dẫn trứng sao cho có sự hiện diện của bong bóng khí (10-12 phôi/ vị trí). Lưu lý khi tạo kim chuyển phôi phải tạo các đoạn môi trường - không khí đan xen nhau để giữ phôi trong kim chuyển phôi và khi chuyển phôi vào ống dẫn trứng để có thể đảm bảo phôi không bị thoát ra ngoài. Sau khi chuyển phôi xong, nhẹ nhàng và nhanh chóng đưa toàn bộ đoạn ống dẫn trứng, buồng trứng, tử cung trở lại ổ bụng, tiếp tục làm tương tự với vị trí còn lại. Sau đó may vết thương và đưa chuột trở lại buồng nuôi, theo dõi sự hồi phục của chuột cho đến ngày chuột sinh con non (19-21 ngày mang thai). Lưu ý, phải kiểm tra trong kim chuyển phôi để chắc chắn toàn bộ phôi trong kim chuyển phôi đã được chuyển vào ống dẫn trứng.
Hình 3.15. Các bước chuyển phôi vào ống dẫn trứng ở chuột mang thai hộ A: Vô trùng vùng lưng đã được xác định để mổ bằng cồn 70%. B: Dùng kéo tạo vết rạch ở lưng khoảng 1 cm. C, D: Chèn kéo (không mở miệng kéo) nhẹ nhàng vào vết rạch và tách lớp da ra khỏi lớp cơ bằng cách mở miệng kéo. E: Dùng kẹp
nắm lấy lớp cơ gần buồng trứng (bên trái hoặc bên phải), đồng thời cắt 1 lỗ nhỏ ở lớp cơ. F: Dùng kẹp nắm lấy buồng trứng và đưa ra ngoài. G: Đoạn buồng trứng, ống dẫn trứng, tử cung được đặt trên lớp gạc vô trùng sao cho không dính
lông và cồn. H, I: Cố định đoạn tử cung, ống dẫn trứng và buồng trứng trên gạc vô trùng bằng nắm cầm sao cho dễ dàng thao tác mà không bị tuột vào bên trong cơ thể chuột. K: Đưa chuột lên kính hiển vi soi nổi và xác định vị trí chuyển phôi.
L: Dùng kéo tạo một lỗ nhỏ ở gần vị trí chuyển phôi để đưa kim chuyển phôi vào ampulla. M: Đưa kim chuyển phôi có phôi và các đoạn bóng khí bên trong vào ống dẫn trứng thông qua lỗ đã tạo trước đó và tiến hành chuyển toàn bộ phôi cần
chuyển. N: Sau khi xác định đã có phôi trong ống dẫn trứng, mở nắm cầm và đưa trả lại vào cơ thể. Tiếp tục thực hiện bên còn lại như quy trình trên. N: vết rạch ở vùng da được kẹp lại bằng kẹp chuyên dụng và đưa trở lại bàn nhiệt ủ ấm
cơ thể cho đến khi chuột tỉnh hoàn toàn và đưa trở lại buồng nuôi.