đoạn đầu HWZZ (E.coliDH5α::pJET::HWZZ), đoạn cuối TWZZ (E.coliDH5α::pJET::TWZZ) và đoạn cuối TAHA (E.coliDH5α::
pJET::TAHA)
Kết quả PCR khuẩn lạc khuếch đại 3 đoạn HWZZ, TWZZ và TAHA với cặp primer tương ứng thể hiện trên hình 4.1, từ kết quả điện di trên gel agarose 1.2%
cho thấy sản phẩm của phản ứng khuếch đại chỉ chứa duy nhất đoạn DNA có kích thước tương ứng với kích thước theo lý thuyết lần lượt là 436 bp, 444 bp và 411 bp (hình 4.1).
Kết quả kiểm các khuẩn lạc nhân dòng 3 đoạn HWZZ, TWZZ và TAHA trong trong E.coliDH5α qua công cụ pJET1.2/blunt bao gồm kết quả kiểm tra bằng PCR khuẩn lạc (hình 4.2, hình 4.3, hình 4.4) và kiểm tra bằng phản ứng cắt giới hạn (hình 4.5).
Theo kết quả hình 4.2, sản phẩm PCR khuếch đại bằng cặp mồi FpJET/RpJET khi kiểm tra nhân dòng cho vạch có kích thước từ 500-600 bp (giếng 2), đúng với kích thước trên lý thuyết của đoạn được tạo dòng là đoạn HWZZ (436 bp); bên cạnh đó, kết quả hình 4.5(a) và 4.5(b) cho thấy sản phẩm cắt bằng enzym cắt giới hạn SacI và BamHI có 2 vạch với vạch thấp hơn tương ứng với chiều dài đoạn HWZZ và vạch cao hơn tương ứng với chiều dài pJET1.2/blunt là 2.9 kp, vậy đoạn HWZZ đã được tạo dòng thành công.
Theo kết quả hình 4.3, sản phẩm PCR khuếch đại bằng cặp mồi FpJET/RpJET khi kiểm tra nhân dòng cho vạch có kích thước từ 500-600 bp (từ giếng 1 đến 5), đúng với kích thước trên lý thuyết của đoạn được tạo dòng là đoạn TWZZ (444 bp);
còn kết quả hình 4.5(c) cho thấy sản phẩm cắt bằng enzym cắt giới hạn BamHI và XbaI có 2 vạch với vạch thấp hơn tương ứng với chiều dài đoạn TWZZ và vạch cao hơn tương ứng với chiều dài pJET1.2/blunt là 2.9 kp, vậy đoạn TWZZ đã được tạo dòng thành công.
Theo kết quả hình 4.4, sản phẩm PCR khuếch đại bằng cặp mồi FpJET/RpJET khi kiểm tra nhân dòng cho vạch có kích thước từ 500-600 bp, đúng với kích thước trên lý thuyết của đoạn được tạo dòng là đoạn TAHA(411 bp); còn kết quả hình 4.5(d) cho thấy sản phẩm cắt bằng enzym cắt giới hạn BamHI và XbaI có 2 vạch với vạch thấp hơn tương ứng với chiều dài đoạn TAHA và vạch cao hơn tương ứng với chiều dài pJET1.2/blunt là 2.9 kp, vậy đoạn TAHA đã được tạo dòng thành công.
Tóm lại, từ kết quả PCR khuẩn lạc nhân dòng (hình 4.2 - 4.3 - 4.4) và kết quả kiểm tra bằng enzym cắt giới hạn (hình 4.5 (a) - 4.5 (b) - 4.5 (c) - 4.5 (d)) cho thấy 3 đoạn HWZZ, TWZZ và TAHA đã được nhân dòng thành công.
Các đoạn HWZZ, TWZZ và TAHA đã nhân dòng được giải trình tự, kết quả giải trình tự dùng so sánh với dữ liệu trên Genbank bằng công cụ BLAST (NCBI) như hình 4.6, 4.7 và 4.8. Kết quả so sánh cho thấy đoạn được nhân dòng có sự tương đồng với dữ liệu Genbank của A.hydrophila ATCC 7966 như sau: đoạn HWZZ tương đồng 99%, đoạn TWZZ tương đồng 96%, đoạn TAHA tương đồng 97%. Với
kết quả giải trình tự và so sánh với dữ liệu Genbank trên thì các đoạn nhân dòng HWZZ, TWZZ và TAHA sẽ được tiếp tục sử dụng cho các bước thí nghiệm tạo dòng tiếp theo.
Hình 4.6 : Kết quả so sánh trình tự đoạn HWZZ với dữ liệu trên genbank của NCBI bằng công cụ Blast
Hình 4.7 : Kết quả so sánh trình tự của đoạn TWZZ với dữ liệu trên genbank của NCBI bằng công cụ Blast
Hình 4.8 : Kết quả so sánh trình tự của đoạn TAHA với dữ liệu trên genbank của NCBI bằng công cụ Blast
III.1.2. Tạo dòng Escherichia coli DH5α mang vector pJET chứa đoạn đầu - cuối HTWZZ (E.coliDH5α::pJET::HTWZZ) và HTAHA (E.coliDH5α::
pJET:: HTAHA)
Kết quả kiểm tra nhân dòng sản phẩm nối giữa pJET::HWZZ mở vòng với đoạn cuối TWZZ và với đoạn cuối TAHA bao gồm kết quả kiểm tra bằng PCR khuẩn lạc (hình 4.9, hình 4.10) và kiểm tra bằng phản ứng cắt giới hạn (hình 4.11).
Theo kết quả hình 4.9, sản phẩm PCR khuếch đại bằng cặp mồi WZZF1/WZZR2 (giếng 8) xuất hiện vạch có kích thước từ 900-1000 bp phù hợp với tổng kích thước của hai đoạn đầu HWZZ và cuối TWZZ sau khi đã được nối với nhau (880 bp); ngoài ra hình 4.11(a) là kết quả điện di sản phẩm cắt giới hạn trên pJET::HTWZZ bằng SacI và XbaI cho thấy sản phẩm gồm 2 vạch với vạch thấp hơn có kích thước từ 800-900 bp phù hợp với chiều dài HWZZ nối với TWZZ, và vạch cao hơn có kích thước từ 2.5 kb – 3 kb phù hợp với kích thước pJET1.2/blunt là 2.9 kb. Các kết quả trên chứng tỏ sản phẩm nối HTWZZ đã được tạo dòng thành công trong E.coliDH5α bằng công cụ pJET1.2/blunt.
Kết quả điện di hình 4.10 cho thấy sản phẩm PCR khuếch đại bằng cặp mồi WZZF1/AHAR2 (giếng 1, 3 và 11) xuất hiện vạch kích thước từ 900-1000 bp phù hợp với tổng kích thước của hai đoạn đầu HWZZ và cuối TAHA sau khi được nối với nhau (847 bp); ngoài ra hình 4.11(b) là kết quả điện di sản phẩm cắt giới hạn trên pJET::HTAHA bằng SacI và XbaI cho thấy sản phẩm là 2 vạch với vạch thấp
hơn cho kích thước từ 800-900 bp phù hợp với chiều dài HWZZ nối với TAHA, và band cao hơn có kích thước 2.5 kb – 3 kb phù hợp với kích thước pJET1.2/blunt là 2.9 kb. Các kết quả trên chứng tỏ sản phẩm nối HTAHA đã được tạo dòng thành công trong E.coliDH5α bằng công cụ pJET1.2/blunt.
Tóm lại, từ kết quả kiểm tra bằng PCR khuẩn lạc (hình 4.9 - 4.10) và kiểm tra bằng enzym cắt giới hạn (hình 4.11) cho thấy hai đoạn HTWZZ và HTAHA đã được nhân dòng thành công.
III.1.3. Tạo dòng Escherichia coli DH5α mang vector pJET chứa gene kháng kanamycin ( E.coliDH5α::pJET::KmR)
Sản phẩm PCR khuếch đại bằng cặp mồi FKm/RFm trên bản mẫu plasmid pCAMBIA thể hiện trên gel agarose 1.2% cho thấy chỉ chứa duy nhất đoạn DNA (1.2-1.5 kb) có kích thước tương ứng với kích thước trên lý thuyết là 1327 bp của gen kháng Kanamycin (hình 4.12).
Kết quả kiểm tra các khuẩn lạc nhân dòng sản phẩm nối pJET::KmR bao gồm:
kết quả kiểm tra bằng PCR khuẩn lạc (hình 4.13) và kiểm tra bằng phản ứng cắt giới hạn (hình 4.14).
Kết quả điện di hình 4.13 cho thấy sản phẩm PCR khuếch đại bằng cặp mồi FpJET/RpJET khi kiểm tra các dòng biến nạp chỉ có duy nhất vạch kích thước từ 1.2 – 1.5 kb (giếng 1, 2 và 11), đúng với kích thước trên lý thuyết của đoạn KmR được tạo dòng.
Sản phẩm của phản ứng cắt giới hạn khi kiểm tra bằng enzyme BamHI trên gel agarose 1.2% (hình 4.14) cho thấy sản phẩm cắt có 2 vạch với vạch thấp hơn tương ứng với kích thước của gen kháng Kanamycin KmR (từ 1.2-1.5 kb) và vạch cao hơn tương ứng với kích thước của plasmid pJET1.2/blunt (từ 2.5 – 3 kb).
Vậy gen KmR đã được tạo dòng thành công trong chủng E.coliDH5α bằng công cụ pJET1.2/blunt.
III.1.4. Tạo dòng Escherichia coli DH5α mang vector pJET chứa cassette HKTWZZ và HKTAHA (E.coliDH5α::pJET::HKTWZZ và E.coliDH5α::
pJET ::HKTAHA)
Sản phẩm của phản ứng cắt giới hạn mở vòng plasmid pJET::HTWZZ và PJET:HTAHA bằng enzym BamHI như hình 4.15, kết quả điện di chỉ chứa 1 vạch duy nhất 3.5 – 4 kb tương ứng với tổng kích thước của pJET1.2/blunt, đoạn đầu HWZZ và đoạn cuối TWZZ/TAHA (2 – 2.1 kp). Vậy các plasmid đã được cắt mở vòng hoàn toàn.
Các sản phẩm của phản ứng cắt giới hạn gồm pJET::HTWZZ mở vòng, pJET::HTAHA mở vòng và đoạn gen KmR rời được tinh sạch bằng kit iNtRON để dùng trong phản ứng nối tạo 2 loại plasmid tái tổ hợp pJET::HKTWZZ và pJET::HKTAHA. Các khuẩn lạc E.coliDH5α nhân dòng sản phẩm nối được kiểm tra bằng PCR khuẩn lạc (hình 4.16 và hình 4.17) và phản ứng cắt giới hạn (hình 4.18).
Theo hình 4.16, khi PCR khuẩn lạc E.coliDH5α nhân dòng pJET::HTWZZ bằng mồi FpJET/RpJET thì giếng 8 và 9 chỉ xuất hiện vạch kích thước từ 2 – 2.5 kb tương ứng với kích thước của sản phẩm nối giữa đoạn đầu - cuối HTWZZ với gen KmR trên lý thuyết là 2207 bp; ngoài ra, theo hình 4.18 (giếng 1) khi thực hiện phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp pJET::HKTWZZ bằng BglII cho ra sản phẩm là 2 vạch từ 2 – 2.5 kb và 2.5 – 3 kb tương ứng với chiều dài trên lý thuyết của đoạn cassette HKTWZZ (2207bp) và plasmid pJET1.2/blunt (2974bp). Vậy cassette HKTWZZ đã được tạo dòng thành công.
Theo hình 4.17, khi PCR khuẩn lạc E.coliDH5α nhân dòng pJET::HTAHA bằng mồi FpJET/RpJET thì giếng 3,4,5,6,7,8,9 và 11 chỉ xuất hiện band kích thước từ 2 – 2.5 kb tương ứng với kích thước của sản phẩm nối đoạn đầu – cuối HTAHA với gen KmR trên lý thuyết là 2174 bp ; ngoài ra, theo hình 4.18 (giếng 7) khi thực hiện phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp pJET::HKTAHA bằng BglII cho ra sản phẩm
là 2 band từ 2 – 2.5 kb và 2.5 – 3 kb tương ứng với chiều dài trên lý thuyết của đoạn cassette HKTAHA (2174bp) và plasmid pJET1.2/blunt (2974bp). Vậy cassette HKTAHA đã được tạo dòng thành công.
Ngoài ra, cũng theo hình 4.18 (giếng 2 và 5) khi kiểm tra 2 plasmid tái tổ hợp này với enzyme BamHI và XbaI cho kết quả như sau:
- Khi cắt kiểm tra plasmid pJET::HKTWZZ cho ra 3 band (giếng 2) gồm 5-6 kb, 3.5-4 kb và 1.2-1.5 kb tương ứng với các đoạn pJET::HKTWZZ mở vòng (5181 bp), pJET::HTWZZ (3854) và KmR (1327 bp) trên lý thuyết.
- Khi cắt kiểm tra pJET::HKTAHA cũng cho ra 3 band (giếng 5) gồm 3-3.5 kb, 1.2-1.5 kb và 400-500 bp tương ứng với các đoạn pJET::HWZZ (3410 bp), KmR (1327bp) và TWZZ (411 bp) trên lý thuyết.
Sự khác nhau về sản phẩm cắt giữa hai plasmid là do tác động của yếu tố thời gian lên phản ứng, khi thời gian phản ứng kéo dài thêm 30 phút thì sản phẩm cho ra 3 vạch như ở phản ứng cắt pJET::HKTAHA. Kết quả thu được đúng với lý thuyết khi thiết kế tạo dòng dòng cassette HKTWZZ và cassette HKTAHA.
Tóm lại, từ kết quả kiểm tra PCR khuẩn lạc nhân dòng (hình 4.16 – 4.17) và kết quả kiểm tra bằng enzym cắt giới hạn (hình 4.18) cho thấy hai cassette HKTWZZ và HKTAHA đã được tạo dòng thành công trong chủng E.coliDH5α bằng công cụ pJET1.2/blunt.