III.3.1. Kết quả chọn lọc dòng vi khuẩn đột biến sau khi tiếp hợp
Dịch vi khuẩn thu được sau khi tiếp hợp được trải chọn lọc trên đĩa môi trường LBagar có bổ sung kháng sinh chọn lọc Kanamycin và Colistine (LB-Kan-Col), sau 16 giờ ủ ở điều kiện 37oC xuất hiện các khuẩn lạc có hình dạng như sau: tròn, lồi, trắng đục, Φ từ 0.8 – 1.5 mm, màu vàng sáng (hình 4.26).
Các khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa môi trường chọn lọc LB-Kan-Col được kiểm tra theo phương pháp đã trình bày ở mục 3.4.2.
III.3.2. Kiểm tra tiếp hợp giữa Aeromonas hydrophila ATCC 7966 và SM10λpir::pGP704::HKTWZZ
Kết quả của quá trình tiếp hợp và chọn lọc trên môi trường LB-Kan-Col thu được 10 khuẩn lạc, tiến hành kiểm tra 10 khuẩn lạc theo phương pháp đã trình bày ở mục 3.4.2.
Theo hình 4.27, kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc bằng cặp mồi WZZF1/WZZR2 cho thấy ở giếng 6 (khuẩn lạc 10) và ở giếng 10 (khuẩn lạc 13) đều xuất hiện vạch từ 2-2.5 kb tương ứng với kích thước cassette HKTWZZ (2207bp). Hai khuẩn lạc 10 và 13 được kiểm tra lại lần 2 bằng PCR khuẩn lạc với cùng cặp mồi trên, kết quả trên hình 4.28 cho thấy rõ như sau:
- Khuẩn lạc 10 xuất hiện cả 2 vạch tương ứng cassette HKTWZZ (2207 bp) và vạch tương ứng với đoạn WZZ (1368 bp) nguyên thủy.
- Khuẩn lạc 13 chỉ cho duy nhất 1 vạch tương ứng cassette HKTWZZ (2207 bp).
Theo kết quả kiểm tra ở hình 4.27 và 4.28 thì ở dòng tế bào 10 chứa cả cassette HKTWZZ và đoạn WZZ nguyên thủy trong genome, chứng tỏ đoạn WZZ chưa được loại bỏ hoàn toàn (tái tổ hợp tương đồng một điểm); trong khi đó, genome của dòng tế bào 13 chỉ chứa cassette HKTWZZ đã thay thế hoàn toàn đoạn WZZ nguyên thủy ban đầu trên A.hydrophila ATCC 7966, vậy dòng tế bào 13 có thể là dòng tế bào cần tìm.
Dòng tế bào 13 được cấy chuyền và kiểm tra tiếp với các cặp mồi còn lại theo mục 3.4.2 như sau: AerF/AerR (hình 4.29), FKm/RKm (hình 4.30), WZZF3/WZZR3 (hình 4.31), WZZF4/AHAR3 (hình 4.32).
Theo hình 4.29, khuẩn lạc 13 cho vạch tương ứng kích thước 191 bp khi PCR khuếch đại gen Aerolysin (hemolysin) bằng mồi AerF/AerR, chứng tỏ dòng tế bào 13 là A.hydrophila.
Theo hình 4.30, dòng tế bào 13 và SM10λpir::pGP704::HKTWZZ đều cho vạch tương ứng kích thước 1327 bp (giếng 2 và 4) khi PCR khuếch đại gen Kanamycin bằng mồi FKm/RKm, kết quả này cho thấy đoạn gen Kanamycin đã được chèn vào genome thông qua cassette HKTWZZ, vậy dòng tế bào 13 có chứa cassette HKTWZZ.
Ngoài ra theo hình 4.31, khuẩn lạc 13 cho kết quả âm tính (giếng 2) khi PCR khuếch đại bằng mồi WZZF3/WZZR3, kết quả này cho thấy đoạn WZZ nguyên thủy không còn hiện diện trên genome nên mồi không bắt cặp được, vậy dòng tế bào 13 đã loại bỏ hoàn toàn đoạn cần phải loại bỏ là đoạn WZZ (528 bp) ra khỏi genome.
Theo hình 4.32, dòng tế bào 13 chỉ xuất hiện duy nhất vạch tương ứng kích thước 3622 bp (giếng 3) còn A.hydrophila hoang dại xuất hiện vạch dài 2823 bp (giếng 4) khi PCR khuếch đại bằng mồi WZZF4/AHAR3, kết quả này cho thấy cassette HKTWZZ đã thay thế đoạn WZZ nguyên thủy nên vạch có kích thước lớn hơn và phù hợp với kích thước dự đoán, vậy dòng tế bào 13 chứa cassette HKTWZZ thay thế cho WZZ nguyên thủy trên genome.
Từ những kết quả kiểm tra trên có thể kết luận rằng dòng tế bào 13 là dòng vi khuẩn A.hydrophila đột biến gen Wzz loại I, kí hiệu là A.hydrophila M13-Wzz.
III.3.3. Kiểm tra tiếp hợp giữa Aeromonas hydrophila ATCC 7966 và SM10λpir:: pGP704::HKTAHA
Kết quả của quá trình tiếp hợp giữa 2 dòng vi khuẩn và chọn lọc trên môi trường LB-Kan-Col thu được 13 khuẩn lạc. Tiến hành kiểm tra 13 khuẩn lạc đơn tiếp hợp theo mục 3.4.2.
Theo hình 4.33, các khuẩn lạc tiếp hợp khi kiểm tra PCR khuẩn lạc bằng cặp mồi kiểm tra cassette WZZF1/AHAR3 cho thấy hầu như tất cả các khuẩn lạc đem kiểm tra đều xuất hiện đột biến:
- Ở các giếng 1-7, 9, 10 và 13 đều cho 2 vạch tương ứng với chiều dài cassette HKTAHA (2097 bp) và chiều dài đoạn AHA nguyên thủy (2812 bp).
- Giếng 8 và 11 chỉ xuất hiện duy nhất 1 vạch từ 2-2.5 kb tương ứng với kích thước cassette HKTAHA (2097 bp).
Theo kết quả kiểm tra ở hình 4.33 thì ở các dòng tế bào 1-7, 9, 10 và 13 chứa cả cassette HKTAHA và đoạn AHA nguyên thủy trong genome, chứng tỏ đoạn AHA chưa được loại bỏ hoàn toàn (tái tổ hợp tương đồng một điểm); trong khi đó, genome của dòng tế bào 8 và 11 chỉ chứa cassette HKTAHA thay thế đoạn AHA nguyên thủy ban đầu trên A.hydrophila ATCC 7966, vậy dòng tế bào 8 và 11 có thể là dòng tế bào đột biến cần tìm.
Dòng tế bào 8 và 11 được cấy chuyền và kiểm tra tiếp với các cặp mồi còn lại theo mục 3.4.2 như sau: AerF/AerR (hình 4.34), FKm/RKm (hình 4.35), WZZF3/WZZR3 (hình 4.35), WZZF4/AHAR3 (hình 4.36).
Theo hình 4.34, hai khuẩn lạc 8 và 11 đều cho vạch tương ứng kích thước 191 bp (giếng 1 và 2) khi PCR khuếch đại gen Aerolysin (hemolysin) bằng mồi AerF/AerR, chứng tỏ rằng hai dòng tế bào 8 và 11 đều là A.hydrophila.
Theo hình 4.35, cả 2 dòng tế bào 8 và 11 đều cho vạch tương ứng kích thước 1327 bp (giếng 5 và 6) khi PCR khuếch đại gen Kanamycin bằng mồi FKm/RKm, kết quả này cho thấy đoạn gen Kanamycin đã được chèn vào genome thông qua cassette HKTAHA, vậy hai dòng tế bào 8 và 11 có chứa cassette HKTAHA.
Ngoài ra, cũng theo hình 4.35 thì cả 2 dòng tế bào 8 và 11 đều cho kết quả âm tính (giếng 1 và 2) khi PCR khuếch đại bằng mồi WZZF3/WZZR3, kết quả này cho thấy đoạn AHA nguyên thủy không còn hiện diện trên genome nên mồi không bắt
cặp được, vậy hai dòng tế bào 8 và 11 đã được loại bỏ hoàn toàn đoạn cần phải loại bỏ là đoạn AHA (2079 bp) ra khỏi genome.
Hình 4.36 cho thấy hai khuẩn lạc đều chỉ cho duy nhất 1 vạch tương ứng kích thước 2071 bp (giếng 3 và 4) còn A.hydrophila hoang dại xuất hiện vạch dài 2823 bp (giếng 6) khi PCR khuếch đại bằng mồi WZZF4/AHAR3, kết quả này cho thấy cassette HKTAHA đã thay thế đoạn AHA nguyên thủy nên vạch có kích thước nhỏ hơn và phù hợp với kích thước dự đoán, vậy hai dòng tế bào 8 và 11 chứa cassette HKTAHA thay thế cho AHA nguyên thủy trên genome.
Từ những kết quả kiểm tra trên có thể kết luận rằng hai dòng tế bào 8 và 11 là dòng vi khuẩn A.hydrophila đột biến gen Wzz loại II, kí hiệu là A.hydrophila MA8- Wzz và A.hydrophila MA11-Wzz.