3.3.1. Phân tích cộng hưởng từ hạt nhân 1HNMR
Một số nguyên tố có hạt nhân hoạt động bằng cách tự xoay xung quanh trục của nó tương tự những thanh nam châm nhỏ và vì vậy chúng sẽ tương tác với từ trường ngoài. Hydrogen 1H và carbon 13C là hai nguyên tố có tính chất đó. Các proton không tương đương sẽ cộng hưởng tại một lực từ trường khác nhau và cho tín hiệu ở các vị trí khác nhau trên phổ. Với các hợp chất hữu cơ, độ dịch chuyển hóa học là đại lượng có thể đặc trưng cho các proton trong các liên kết hóa học.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1HNMR được đo bằng máy Bruker Avance AM500 FT-NMR/ Đứctại Viện hóa học, viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam tại Hà Nội.
3.3.2. Phương pháp sắc kí gel GPC
Kích thước, trọng lượng phân tử và độ đa phân tán là những đặc tính quan trọng của một hợp chất hóa học. Phương pháp sắc kí gel được sử dụng để xác định khối lượng phân tử của hợp chất hóa học dựa trên nguyên lý phân tách các hợp chất không mang điện tích theo thứ tự trọng lượng phân tử của chúng.
46
Phương pháp này được đo bằng máy sắc ký PL-GPC 50 của hãng Polymerlab, tại PTN trọng điểm vật liệu Polyme và Compozit.
3.3.3. Phương pháp thử nghiệm nghịch chuyển (Investing test method) Trạng thái chuyển pha sol (chảy) - gel (không chảy) của pentablock trong môi trường nước được xác định bằng phương pháp thử nghiệm nghịch chuyển (Inverting test method). Phương pháp này được tiến hành như sau: Sử dụng 1 lọ nhỏ loại 10ml, đường kính lọ 10mm. Pentablock được hòa tan trong dung dịch đệm PBS với một nồng độ cho trước ở 10C và pH của mẫu được điều chỉnh bằng dung dịch NaOH (5M) hoặc HCl (5M). Dung dịch sau khi hòa tan hoàn toàn được giữ ổn định ở 00C trong vòng 1-2 ngày trước khi đem khảo sát. Sự chuyển pha sol-gel ở mỗi nhiệt độ được xác định bằng góc ngang của ống nghiệm sau khi giữ nó ở một nhiệt độ không đổi trong vòng 10 phút [9-11].
3.3.4. Xác định pKa và đo khả năng nhạy pH
Khả năng nhạy pH được đo bằng máy đo pH, ghi nhận kết quả và xây dựng đồ thị. Từ đồ thị ta suy ra các kết quả về pKa (hay pKb), điểm bắt đầu nhạy, điểm kết thúc nhạy và khoảng nhạy bằng phương pháp đường cong chuẩn độ [9-11].
Chuẩn bị dung dịch oligomer bằng cách cho mẫu oligome vào dung dịch đệm pH cho đến khi nồng độ oligomer đạt 0.1%wt. Sau đó tiến hành như sau: Đối với oligomer nhạy pH loại nhạy anion (cation) nhỏ thêm vào dung dịch NaOH 5N (hoặc HCl 5N) trước khi đo để đưa pH dung dịch về 12-13 (1-2). Sau đó sử dụng HCl 0.1N (NaOH 0.1N) nhỏ từ từ từng giọt vào dung dịch, sử dụng máy đo pH ghi lại số liệu để lập đường cong đánh giá khả năng nhạy pH của oligomer.
Các giá trị thu nhận từ đồ thị được định nghĩa như sau:
− Điểm bắt đầu nhạy pH là giá trị mà tại đó quá trình đề ion hóa của polymer bắt đầu xảy ra khi ta thay đổi giá trị pH của môi trường.
47
− Cách 2: (điểm uốn) được xác định dựa trên đạo hàm bậc 2 của phương trình:
2 0
2
dV d
NaOH pH
Luận văn này đã sử dụng cách 1 để xác định pKa của các dung dịch polymer.
Các bước xác định giá trị nhạy pH của polymer được thực hiện như sau:
Hình 3.1. Dạng đồ thị nhạy pH
− Đầu tiên vẽ các tiếp tuyến của các phần uốn trên đồ thị.
0 2 4 6 8 10 12
0 5 10 15
pH
HCl (ml)
Đường cong Titration
48
− Từ các giao điểm của các tiếp tuyến ta xác định được điểm bắt đầu nhạy và kết thúc nhạy bằng cách đọc giá trị pH tương ứng trên trục tung (trục pH).
− Khoảng nhạy pH được xác định là khoảng cách từ điểm bắt đầu nhạy pH đến điểm kết thúc nhạy.
Giá trị pKa (pKb) được xác định là trung điểm của đoạn từ điểm bắt đầu nhạy pH đến kết thúc nhạy. Từ trung điểm chiếu sang trục tung. Giá trị ghi trên trục tung là giá trị pKa (pKb) tương ứng.
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn cách xác định pKa và bước nhạy pH 3.3.5. Phương pháp phân tích bề mặt SEM
Nguyên lý hoạt động của SEM là tạo một chùm điện tử rất mạnh và điều khiển chùm điện tử này quét theo hàng và theo cột trong diện tích rất nhỏ trên bề mặt mẫu nghiên cứu. Chùm tia phản xạ từ mẫu được ghi nhận và chuyển thành hình ảnh.
Ảnh SEM cho các thông tin về hình thái bề mặt, đường kính cũng của các hạt Chitosan thu được.
0 2 4 6 8 10 12
0 5 10 15
pH
HCl (ml)
Đường cong Titration
điểm bắt đầunhạy pH
giá trị pKa bước nhạy
điểm kết thúc nhạy pH
49
3.3.7. Phân tích hàm lượng Insulin bằng phương pháp HPLC
Phương pháp HPLC (High performance liquid chromatography) cho phép phân tích định tính và định lượng insulin trong hạt Chitosan. Mẫu được Phân tích Tại Khoa Hóa Trường Đại Học Công nghiệp TPHCM.
3.3.8. Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)
Khối hydrogel sau khi được thành sẽ được đem phân tán trong nước (kết hợp với máy đánh siêu âm), sau đó một lượng nhỏ dung dịch nhũ tương này sẽ được quét trên tấm đế để tiến hành quan sát bằng Kính hiển vi điện tử truyền qua.
TEM cho phép quan sát cấu trúc của hydrogel trong dung dịch nước tại điều kiện pH và nhiệt độ xác định. Thiết bị: Máy TEM Phòng TNTĐQG Polymer &
Composite.
3.3.9. Khảo sát chuyển pha sol-gel và phân hủy sinh học in-vivo
Sự phân hủy in vivo của gel được tiến hành trên chuột bạch cái (SD), loại có trọng lượng từ 35g-40g. Sử dụng 200àl dung dịch copolymer 30 wt% ở pH=10.0 và nhiệt độ 50C được tiêm vào dưới da ở vùng lưng của chuột SD sau 1 thời gian x tuần mổ vùng lưng của chuột (vị trí tiêm) ra để kiểm tra kích thước của gel. Căn cứ vào kích thước gel để đánh giá khả năng phân hủy của copolymer.
50