2.3. Ứng dụng của hydrogel nhạy pH/nhiệt độ và hạt micro-nano làm hệ vận chuyển thuốc
2.3.2. Ứng dụng của hạt micro-nano
Các hạt polymer được sử dụng để điều khiển quá trình vận chuyển thuốc đã được nghiên cứu rộng rãi từ 50 năm trở lại đây. Có rất nhiều bài báo cáo về quá trình chuẩn bị, sự ảnh hưởng của các thông số đến quá trình nhả thuốc và những khó khăn phải đối mặt trong suốt quá trình. Hầu hết những bài báo cáo đều tiến hành tạo hạt bằng phương pháp truyền thống và hạn chế rất nhiều thông tin về cơ chế nhả thuốc [14].
Một cách tổng quát, quá trình nhả thuốc xảy ra theo hai cơ chế khác nhau:
khuếch tán thụ động và sự phân hủy của polymer. Theo lý thuyết, hệ vận chuyển thuốc phải giải phóng thuốc theo bậc không, nghĩa là hàm lượng thuốc nhả ra phải là hằng số theo thời gian. Tuy nhiên, quá trình nhả thuốc của các hạt lại chia thành hai quá trình dễ dàng nhận biết [14]:
39
polymer; hình thái, độ xốp và sự phân bố kích thước hạt. Các phân tử thuốc thường được sử dụng trong các hệ dẫn truyền thuốc bằng hạt polymer là các thuốc trị ung thư, các loại thuốc kháng sinh hay một vài loại protein...[46].
Hình 2.28. Một số loại thuốc thường được đưa vào hạt polymer
40
Có khá nhiều bài báo cho thấy quá trình nhả thuốc từ hạt polymer cho kết quả khá tốt, nồng độ thuốc đạt được sự cân bằng trong thời gian tiến hành nhả thuốc. Sau đây là một vài ví dụ về hệ vận chuyển thuốc bằng hạt polymer.
Chi–Hwa Wang và các cộng sự của mình đã chế tạo thành công hạt Polycaprolactone chứa Paclitaxel nhằm chữa bệnh ung thư vú [39]. Kết quả cho thấy hạt tạo thành có kích thước khá đồng đều, kích thước 7-11 μm. Quá trình nhả thuốc cũng đạt hiệu quả khá cao.
Hình 2.29. Hệ vận chuyển Paclitaxel bằng hạt Polycaprolactone: Hình dạng hạt và biểu đồ quá trình nhả thuốc
Neha Arya và các cộng sự cũng đã chế tạo hệ vận chuyển Ampicillin bằng hạt Chitosan bằng phương pháp electrospraying [37]. Hạt thu được có đường kính trung bình khoảng 0,5 μm. Quá trình nhả thuốc cũng cho thấy sự nhả thuốc cũng đạt kết quả khá tốt.
Hình 2.30. Hệ vận chuyển Ampicillin bằng hạt Chitosan: Hình dạng hạt và biểu đồ quá trình nhả thuốc
41 hydrogel nhạy nhiệt độ PLGA – PEG – PLGA.
Hình 2.31. Mô phỏng quá trình tạo hệ vận chuyển thuốc trên cơ sở kết hợp hydrogel và hạt
Hình 2.32. Biểu đồ so sánh kết quả nhả thuốc của từng hệ riêng biệt và hệ kết hợp hydrogel - hạt micro-nano
42
Kết quả thu được cho thấy hệ kết hợp hydrogel – hạt có hiệu quả hơn rất nhiều so với từng hệ riêng biệt. Hiện tượng nhả thuốc bùng nổ được cải thiện và thời gian nhả thuốc được kéo dài hơn.
Ngoài ra hạt miceo-nano còn được sử dụng để kết hợp với sợi electrospun.
Trong rất nhiều loại giá thể được tạo ra trong lĩnh vực tái tạo mô, giá thể được tạo từ sợi polymer có kích thước nano đang được xem là một trong những ứng viên tiềm năng nhất. Trong một số trường hợp, để tăng hiệu quả của giá thể, người ta thường kết hợp sợi với các hạt để tạo giá thể [14].
Hình 2.33. Quá trình kết hợp hạt vào sợi electrospuns
43 D,L-Serine
Chất rắn màu trắng, dạng tinh thể, hình kim, dễ tan trong nước.
Nhiệt độ nóng chảy: 2400C
nhạy pH
2
Benzenesulfonyl chloride
Công thức phân tử: C6H5ClO2S.
Độ tinh khiết: 99%
Khối lượng phân tử: M = 176.62g/mol
Khối lượng riêng: 1.384g/cm3 tại 250C
Sigma-Aldrich – Nguyên liệu chính để
tổng hợp oligomer nhạy pH
3 Sodium hydroxide
Công thức phân tử NaOH Khối lượng phân tử: M = 40g/mol.
Độ tinh khiết: 95%
Xilong Trung Quốc – tạo môi trường cho
phản ứng tạo sulfonamide
4 N,N′-
Dicyclohexylcarboiimide (DCC)
Công thức phân tử: C13H22N2
Độ tinh khiết: 99%
Khối lượng phân tử: M = 206.33g/mol
Chất rắn màu trắng, dạng tinh thể.
Nhiệt độ nóng chảy: 34-350C
Sigma-Aldrich –
“coupling agent” cho phản ứng ester hóa
5
4-(Dimethylamino)pyridine (DMAP)
Công thức phân tử C7H10N2
Khối lượng phân tử: M = 122.17g/mol.
Nhiệt độ nóng chảy: 108-1100C Chất rắn màu be hoặc không
màu.
Sigma-Aldrich –xúc tác cho phản ứng ester hóa
6 Poly(ethylene glycol)- block-poly(ε-caprolactone)
Triblock copolymer PCL- PEG-PCL
Dạng rắn, màu trắng.
PEG: Mn=1750 và 2050.
PEG/PCL (w/w): 1.8
Tự tổng hợp (kiểm tra lại bằng 1H-NMR) – tổng hộp pentablock
44
TT Hóa chất Thông số Nhà cung cấp - Công
dụng
7
1,4-Dioxane
Công thức phân tử: C4H8O2. Độ tinh khiết: 99%
Khối lượng phân tử: M = 88.11 g/mol
Dạng chất lỏng trong suốt
Prolabo – dung môi cho phản ứng tạo nhóm
sulfonamide.
8
N,N-Dimethylformamide (DMF)
Công thức phân tử: C3H7NO.
Độ tinh khiết: 99%
Khối lượng phân tử: M = 73.09g/mol Dạng chất lỏng trong suốt
Merck – dung môi cho phản ứng tạo oligomer
và tạo pentablock.
9 Cloroform
Công thức phân tử: CHCl3
Khối lượng phân tử: M =119.38 g/mol
Là chất lỏng trong suốt
Chemsol- Dung môi dùng để lọc
rửa sản phẩm.
10
Diethyl ether
Công thức phân tử: C4H10O Khối lượng phân tử: M = 74.12
g/mol
Nhiệt độ sôi: 34.6 oC Chất lỏng trong suốt
Xilong – Dung môi dùng để lọc rửa sản
phẩm
11 Nước khử ion
Công thức phân tử: H2O Khối lượng phân tử: M =
18g/mol
Tự lọc (nước RO) – tạo môi trường cho phản
ứng tạo nhóm sulfonamide; lọc rửa
sản phẩm.
12
Ethyl acetate
Công thức phân tử: C4H8O2. Độ tinh khiết: 95%
Khối lượng phân tử: M = 88.11g/mol Dạng chất lỏng trong suốt
Xilong – Dung môi dùng để trích ly sản
phẩm
13
Tetrahydrofuran (THF)
Công thức phân tử: C4H8O.
Độ tinh khiết: 99.5%
Khối lượng phân tử: M = 72.11g/mol Dạng chất lỏng trong suốt
Merck – dung môi hòa tan sản phẩm
14
Magnesium sulfate anhydrous MgSO4 khan
Công thức phân tử: MgSO4. Độ tinh khiết: 99.5%
Khối lượng phân tử: M = 120.37g/mol Dạng chất rắn màu trắng
Xilong – hút ẩm
45
Cân điện tử
Tủ sấy
3.3. Phương pháp phân tích
3.3.1. Phân tích cộng hưởng từ hạt nhân 1HNMR
Một số nguyên tố có hạt nhân hoạt động bằng cách tự xoay xung quanh trục của nó tương tự những thanh nam châm nhỏ và vì vậy chúng sẽ tương tác với từ trường ngoài. Hydrogen 1H và carbon 13C là hai nguyên tố có tính chất đó. Các proton không tương đương sẽ cộng hưởng tại một lực từ trường khác nhau và cho tín hiệu ở các vị trí khác nhau trên phổ. Với các hợp chất hữu cơ, độ dịch chuyển hóa học là đại lượng có thể đặc trưng cho các proton trong các liên kết hóa học.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1HNMR được đo bằng máy Bruker Avance AM500 FT-NMR/ Đứctại Viện hóa học, viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam tại Hà Nội.
3.3.2. Phương pháp sắc kí gel GPC
Kích thước, trọng lượng phân tử và độ đa phân tán là những đặc tính quan trọng của một hợp chất hóa học. Phương pháp sắc kí gel được sử dụng để xác định khối lượng phân tử của hợp chất hóa học dựa trên nguyên lý phân tách các hợp chất không mang điện tích theo thứ tự trọng lượng phân tử của chúng.
46
Phương pháp này được đo bằng máy sắc ký PL-GPC 50 của hãng Polymerlab, tại PTN trọng điểm vật liệu Polyme và Compozit.
3.3.3. Phương pháp thử nghiệm nghịch chuyển (Investing test method) Trạng thái chuyển pha sol (chảy) - gel (không chảy) của pentablock trong môi trường nước được xác định bằng phương pháp thử nghiệm nghịch chuyển (Inverting test method). Phương pháp này được tiến hành như sau: Sử dụng 1 lọ nhỏ loại 10ml, đường kính lọ 10mm. Pentablock được hòa tan trong dung dịch đệm PBS với một nồng độ cho trước ở 10C và pH của mẫu được điều chỉnh bằng dung dịch NaOH (5M) hoặc HCl (5M). Dung dịch sau khi hòa tan hoàn toàn được giữ ổn định ở 00C trong vòng 1-2 ngày trước khi đem khảo sát. Sự chuyển pha sol-gel ở mỗi nhiệt độ được xác định bằng góc ngang của ống nghiệm sau khi giữ nó ở một nhiệt độ không đổi trong vòng 10 phút [9-11].
3.3.4. Xác định pKa và đo khả năng nhạy pH
Khả năng nhạy pH được đo bằng máy đo pH, ghi nhận kết quả và xây dựng đồ thị. Từ đồ thị ta suy ra các kết quả về pKa (hay pKb), điểm bắt đầu nhạy, điểm kết thúc nhạy và khoảng nhạy bằng phương pháp đường cong chuẩn độ [9-11].
Chuẩn bị dung dịch oligomer bằng cách cho mẫu oligome vào dung dịch đệm pH cho đến khi nồng độ oligomer đạt 0.1%wt. Sau đó tiến hành như sau: Đối với oligomer nhạy pH loại nhạy anion (cation) nhỏ thêm vào dung dịch NaOH 5N (hoặc HCl 5N) trước khi đo để đưa pH dung dịch về 12-13 (1-2). Sau đó sử dụng HCl 0.1N (NaOH 0.1N) nhỏ từ từ từng giọt vào dung dịch, sử dụng máy đo pH ghi lại số liệu để lập đường cong đánh giá khả năng nhạy pH của oligomer.
Các giá trị thu nhận từ đồ thị được định nghĩa như sau:
− Điểm bắt đầu nhạy pH là giá trị mà tại đó quá trình đề ion hóa của polymer bắt đầu xảy ra khi ta thay đổi giá trị pH của môi trường.
47
− Cách 2: (điểm uốn) được xác định dựa trên đạo hàm bậc 2 của phương trình:
2 0
2
dV d
NaOH pH
Luận văn này đã sử dụng cách 1 để xác định pKa của các dung dịch polymer.
Các bước xác định giá trị nhạy pH của polymer được thực hiện như sau:
Hình 3.1. Dạng đồ thị nhạy pH
− Đầu tiên vẽ các tiếp tuyến của các phần uốn trên đồ thị.
0 2 4 6 8 10 12
0 5 10 15
pH
HCl (ml)
Đường cong Titration
48
− Từ các giao điểm của các tiếp tuyến ta xác định được điểm bắt đầu nhạy và kết thúc nhạy bằng cách đọc giá trị pH tương ứng trên trục tung (trục pH).
− Khoảng nhạy pH được xác định là khoảng cách từ điểm bắt đầu nhạy pH đến điểm kết thúc nhạy.
Giá trị pKa (pKb) được xác định là trung điểm của đoạn từ điểm bắt đầu nhạy pH đến kết thúc nhạy. Từ trung điểm chiếu sang trục tung. Giá trị ghi trên trục tung là giá trị pKa (pKb) tương ứng.
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn cách xác định pKa và bước nhạy pH 3.3.5. Phương pháp phân tích bề mặt SEM
Nguyên lý hoạt động của SEM là tạo một chùm điện tử rất mạnh và điều khiển chùm điện tử này quét theo hàng và theo cột trong diện tích rất nhỏ trên bề mặt mẫu nghiên cứu. Chùm tia phản xạ từ mẫu được ghi nhận và chuyển thành hình ảnh.
Ảnh SEM cho các thông tin về hình thái bề mặt, đường kính cũng của các hạt Chitosan thu được.
0 2 4 6 8 10 12
0 5 10 15
pH
HCl (ml)
Đường cong Titration
điểm bắt đầunhạy pH
giá trị pKa bước nhạy
điểm kết thúc nhạy pH
49
3.3.7. Phân tích hàm lượng Insulin bằng phương pháp HPLC
Phương pháp HPLC (High performance liquid chromatography) cho phép phân tích định tính và định lượng insulin trong hạt Chitosan. Mẫu được Phân tích Tại Khoa Hóa Trường Đại Học Công nghiệp TPHCM.
3.3.8. Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)
Khối hydrogel sau khi được thành sẽ được đem phân tán trong nước (kết hợp với máy đánh siêu âm), sau đó một lượng nhỏ dung dịch nhũ tương này sẽ được quét trên tấm đế để tiến hành quan sát bằng Kính hiển vi điện tử truyền qua.
TEM cho phép quan sát cấu trúc của hydrogel trong dung dịch nước tại điều kiện pH và nhiệt độ xác định. Thiết bị: Máy TEM Phòng TNTĐQG Polymer &
Composite.
3.3.9. Khảo sát chuyển pha sol-gel và phân hủy sinh học in-vivo
Sự phân hủy in vivo của gel được tiến hành trên chuột bạch cái (SD), loại có trọng lượng từ 35g-40g. Sử dụng 200àl dung dịch copolymer 30 wt% ở pH=10.0 và nhiệt độ 50C được tiêm vào dưới da ở vùng lưng của chuột SD sau 1 thời gian x tuần mổ vùng lưng của chuột (vị trí tiêm) ra để kiểm tra kích thước của gel. Căn cứ vào kích thước gel để đánh giá khả năng phân hủy của copolymer.
50
Hình 3.3. Mô phỏng quy trình thử In Vivo 3.4. Nội dung thực hiện
Trong phạm vi đề tài này, khối lượng công việc cần thực hiện như sau:
1. Khảo sát tổng hợp oligomer nhạy cảm pH từ D,L-Serine (biến tính với Benzenesulfonyl chloride) bằng phương pháp trùng ngưng trong dung dịch với hệ xúc tác DCC/DMAP. Khảo sát khả năng nhạy cảm pH của oligomer theo sự thay đổi khối lượng phân tử.
2. Tổng hợp pentablock copolymer nhạy cảm pH và nhiệt độ trên cơ sở PCL-PEG- PCL và D,L-Serine biến tính bằng phản ứng “coupling”, với hệ xúc tác DCC/DMAP.
3. Đánh giá khả năng phân hủy sinh học in vivo của pentablock nhạy pH/nhiệt độ.
4. Chế tạo hạt micro-nano mang thuốc insulin từ Chitosan bằng phương pháp electrospraying.
5. Đánh giá khả năng mang và nhả thuốc của hạt Chitosan chứa Insulin.
6. Chế tạo hệ vật liệu Hydrogel – hạt micro-nano y sinh mang thuốc insulin.
7. Đánh giá khả năng nhả thuốc in vitro của hệ vận chuyển thuốc từ pentablock kết hợp với hạt chitosan mang Insulin.
Toàn bộ khối lượng công việc được chia thành 3 giai đoạn chính sau:
51
Hình 3.4. Giai đoạn 1 của đề tài
52
Hình 3.5. Giai đoạn 2 của đề tài
53
Hình 3.6. Giai đoạn 3 của đề tài
3.4.1. Quy trình tạo nhóm sulfonamide từ D,L-Serine và Benzenesulfonyl chloride
Thuyết minh quy trình:
60mmol NaOH được hòa tan trong 50ml H2O (được giữ lạnh ở 00C). Sau đó, 30mmol D,L-Serine được thêm vào và hỗn hợp này được khuấy đều tại 00C trong vòng 2h. Tiếp đến, dung dịch của benzenesulfonyl chloride trong 1,4-Dioxane (36mmol Benzenesulfonyl chloride hòa tan trong 28ml 1,4-Dioxane) được nhỏ từ từ vào, khuấy đều tạo 00C trong vòng 10h.
Sau thời gian đó, hỗn hợp phản ứng được rửa trong diethyl ether. Lớp dung dịch nước thu lại sẽ được điều chỉnh về pH 1-2 bằng dung dịch HCl 10%, và đem trích ly với ethyl acetate (EtoAc). Pha hữu cơ sẽ đươc thu lại và loại bỏ nước bằng MgSO4
khan. Sau đó, dung dịch này sẽ được đem đi lọc và cô quay để thu được Benzenesulfonyl-D,L-Serine (mSerine) (dạng bột màu trắng, hơi ngả vàng).
54
Bảng 3.1. Đơn pha chế của phản ứng tạo mSerine
STT Thành phần Tỉ lệ tác chất so với
Serine Ghi chú
1 Serine 1
2 Benzenesulfonyl chloride 1/1.2 mol/mol
3 NaOH 2/1 mol/mol
Hình 3.7. Phản ứng dự đoán tạo mSerine
55
Hình 3.8. Quy trình tạo nhóm sulfonamide từ D,L-Serine và Benzenesulfonyl chloride
Cơ sở lý thuyết: Phản ứng Hinsberg [47]
Phản ứng Hinsberg dùng để phân biệt amine bậc 1, bậc 2 và bậc 3. Cơ sở của thí nghiệm này là dựa trên phản ứng sulfonyl hóa, đó chính là khả năng tham gia phản ứng với dẫn xuất sulfonyl chloride, điển hình là benzensulfonyl chloride C6H5SO2Cl, của các loại amine trên.
56
Cụ thể, amine bậc 1 tham gia phản ứng sulfonyl hóa tạo ra sản phẩm là C6H5SO2-NH-R có khả năng tan trong dung dịch kiềm như NaOH hoặc KOH và không tan trong acid.
Việc sản phẩm không tan trong dung dịch kiềm là do proton ở nhóm –NH có độ linh động cao bởi ảnh hưởng của các hiệu ứng hút điện tử ở các nhóm –SO2, dẫn đến việc bị ion hóa khi ở trong môi trường kiềm, dẫn đến sự tan.
Sản phẩm của amine bậc 2 là C6H5SO2-N-R. Sản phẩm này không tan trong kiềm và cũng không tan trong acid.
Amine bậc 3 không tham gia phản ứng sulfonyl hóa, nghĩa là vẫn thu được chất không tan trong kiềm, tuy nhiên chất này lại có khả năng tan trong acid, điểm khác biệt với sản phẩm của amine bậc 2.
57
Hình 3.9. (a) Sulfonamide; (b) Dạng cộng hưởng của sulfonamide bị ion hóa [48]
Đánh giá và kiểm tra đặc tính của Benzenesulfonyl-D,L-Serine (mSerine) bằng phương pháp phân tích 1HNMR.
Sản phẩm của phản ứng sau đó được tiếp tục sử dụng làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp oligomer nhạy pH.
3.4.2. Quy trình tổng hợp oligomer nhạy pH từ mSerine
Thuyết minh quy trình:
Cân khối lượng mSerine theo đơn pha chế, hòa tan với DMF và cho vào bình cầu. Tiến hành hút chân không và xả khí Argon (lặp lại 3 lần) để hạn chế sự có mặt của oxy không khí.
Hệ xúc tác DCC/DMAP cũng được cân theo đơn pha chế và hòa tan với DMF.
Dung dịch xúc tác sẽ được tiêm vào hệ phản ứng bằng ống tiêm xuyên qua nút cao su ở cổ nhỏ của bình cầu 3 cổ.
Khi hệ xúc tác được tiêm vào dung dịch mSerine thì phản ứng bắt đầu diễn ra.
Hỗn hợp phản ứng từ màu vàng trong suốt dần dần trở nên đục do sự hình thành của sản phẩm phụ DCU không tan trong DMF, tách ra khỏi dung dịch.
58
Sau 1h phản ứng, ngừng khuấy hỗn hợp phản ứng. Tiến hành lọc qua giấy lọc để loại bỏ DCU. Hỗn hợp phản ứng sau đó được hòa tan trong chloroform và sẽ được nhỏ từ từ vào dung dịch HCl 0.5N với mục đích lôi cuốn dung môi DMF từ pha chloroform sang pha nước.
Pha dung dịch chloroform còn lại sẽ được cô đặc và cho kết tủa trong lượng dư diethyl ether. Sản phẩm kết tủa sẽ được đem sấy chân không ở 600C trong vòng 48h.
Sản phẩm oligomer thu được có dạng bột, màu từ vàng sang nâu (lượng xúc tác sử dụng càng nhiều thì càng sậm màu).
Bảng 3.2. Đơn pha chế của phản ứng tạo oligomer nhạy pH STT Thành phần Tỉ lệ tác chất so với
mSerine Ghi chú
1 mSerine 1
2 DMAP 1/10 mol/mol
3 DCC 1/2; 1/1; 2/1; 3/1 mol/mol
4 DMF 9/1; 14/1; 20/1 v/w
Hình 3.10. Phản ứng dự đoán tạo oligomer từ mSerine
59
Hình 3.11. Quy trình tổng hợp oligomer nhạy pH từ mSerine
Cơ sở lý thuyết [49]:
Nhóm carboxyl (-COOH) phản ứng với DCC tạo thành chất trung gian (O- acylurea)…., chất này có hoạt động hóa học tốt hơn axit tự do. O-acylurea có khả năng thực hiện một số phản ứng:
− Phản ứng trưc tiếp với nhóm hydroxyl (-OH) tạo ra ester và sản phẩm phụ là dicyclohexylurea (DCU), DCU không tan trong dung môi và có thể lọc để loại bỏ.
− Tạo ra N –acylurea là chất kém hoạt động do sự epimer hóa.