CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
4.2. Đánh giá khả năng tạo oligomer và tính nhạy pH của oligomer
4.2.1. Đánh giá cấu trúc mạch phân tử oligomer mSerine bằng H 1 -NMR
Hình 4.6. Phổ 1H-NMR của OS trong dung môi DMSO
77
ester hóa hai nhóm chức -COOH và –OH của mSerine.
4.2.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của tỉ lệ thành phần tác chất và dung môi đến trọng lượng phân tử của oligomer tạo thành (thời gian tổng hợp 1h tại nhiệt độ phòng)
Các mẫu sản phẩm oligomer được tổng hợp với tỉ lệ các thành phần thay đổi (thời gian tổng hợp 1h tại nhiệt độ phòng) được đo khối lượng phân tử trung bình số (Mn) và tổng hợp theo bảng sau:
Bảng 4.3. Khối lượng phân tử của các mẫu OS khác nhau
STT Mẫu
Tỉ lệ mol DCC/Serine
Tỉ lệ DMF/mSerine
(v/w)
Mn
1 9-1-2 1/2 9/1 2314
2 9-1 1 9/1 3014
3 9-2 2 9/1 5408
4 9-3 3 9/1 5722
5 14-1-2 1/2 14/1 1455
6 14-1 1 14/1 2133
7 14-2 2 14/1 2907
8 14-3 3 14/1 4438
9 20-1-2 1/2 20/1 1230
10 20-1 1 20/1 1272
11 20-2 2 20/1 1442
12 20-3 3 20/1 1790
78
Hình 4.7. Phổ GPC của các mẫu có tỉ lệ mol DCC/mSerine khác nhau (cùng tỉ lệ DMF/mSerine là 9/1 (v/w))
Hình 4.8. Phổ GPC của các mẫu có tỉ lệ mol DCC/mSerine khác nhau (cùng tỉ lệ DMF/mSerine là 14/1 (v/w))
79
Hình 4.9. Phổ GPC của các mẫu có tỉ lệ mol DCC/mSerine khác nhau (cùng tỉ lệ DMF/mSerine là 20/1 (v/w))
Dựa vào phổ GPC của các mẫu oligomer OS (Hình 4.7-9), chỉ có 1 peak xuất hiện duy nhất xuất hiện biểu diễn cho OS. Từ đó, có thể bước đầu đánh giá được độ tinh khiết của mẫu oligomer OS sau khi tổng hợp là sạch.
Bên cạnh đó, tùy thuộc vào trọng lượng phân tử và độ đa phân tán mà peak xuất hiện sớm hay muộn, và có độ rộng lớn hay nhỏ. Đối với những oligomer OS có Mn
lớn thường xuất hiện sớm hơn các OS có trọn lượng phân tử nhỏ hơn. Và những OS nào có PDI lớn thì phổ GPC thường xuất hiện trên 1 khoảng rộng hơn.
80
Hình 4.10. Khối lượng phân tử OS thay đổi theo lượng DCC và DMF sử dụng Dựa vào đồ thị ở Hình 4.10, khối lượng phân tử trung bình số của OS (Mn) khi tỉ lệ mol DCC/mSerine tăng từ 1/1 đến 3/1. Xu hướng này được quyết định bởi bản chất của phản ứng ester hóa sử dụng DCC làm “coupling agent”. DCC với vai trò là
“coupling agent” sẽ kết hợp với nhóm carboxyl (–COOH) của mSerine thành một trung tâm hoạt động nhằm mục đích kích hoạt khả năng hoạt động của nhóm –COOH này. Tiếp đến, nhờ sự trợ giúp của DMAP là chất xúc tác, trung tâm hoạt động này đã tấn công vào nhóm alcohol (–OH) để hình thành liên kết ester, và tạo ra DCU là sản phẩm phụ. Hơn nữa, DCC phản ứng với nhóm –COOH theo đương lượng 1/1, và không quay trở lại quá trình phản ứng sau khi đã kết hợp với nhóm –COOH. Do đó, với hàm lượng DCC tăng lên, số lượng nhóm –COOH được hoạt hóa càng tăng, dẫn đến khả năng tạo liên kết ester cũng tăng. Kết quả là khối lượng phân tử của mạch oligomer tăng.
Tuy nhiên, Mn của OS cao hay thấp còn phụ thuộc vào nồng độ của các tác chất trong môi trường phản ứng. Cũng từ đồ thị trong Hình 4.10, khi lượng dung môi DMF sử dụng càng nhiều (tăng từ 9ml đến 14ml và 20ml), đồng nghĩa với nồng độ các tác
81
Hình 4.11. Sự thay đổi của PDI theo lượng DMF sử dụng (tỉ lệ mol DCC/Serine là 1/2)
Hình 4.12. Sự thay đổi của PDI theo lượng DMF sử dụng (tỉ lệ mol DCC/Serine là 1/1)
82
Hình 4.13. Sự thay đổi của PDI theo lượng DMF sử dụng (tỉ lệ mol DCC/Serine là 2/1)
Hình 4.14. Sự thay đổi của PDI theo lượng DMF sử dụng (tỉ lệ mol DCC/Serine là 3/1)
Bên cạnh tác động làm giảm Mn, nồng độ các tác chất tham gia phản ứng còn ảnh hưởng tới PDI của oligomer. Cụ thể, khi nồng độ các tác chất giảm, các tác chất có đủ không gian để tiến hành phản ứng, sự cạnh tranh để phát triển mạch của các chuỗi oligomer thấp, nhờ vậy PDI của oligomer có xu hướng giảm. Điều này được thể hiện qua các đồ thị trong Hình 4.11-14.
83
Hình 4.15. Minh họa quá trình đề ion hóa (bên trái) và ion hóa (bên phải) của OS Kết quả cụ thể được mô tả ở bảng dưới:
84
Bảng 4.4. Tính tan của OS theo khối lượng và pH khác nhau
Tính tan của oligomer
pH=12 (NaOH 0.1N) pH=2 (HCl 0.1N)
Mn
1230 Tan Không tan
1272 Tan Không tan
1442 Tan Không tan
1455 Tan Không tan
1790 Tan Không tan
2133 Tan Không tan
2314 Tan Không tan
2907 Không tan Không tan
3014 Không tan Không tan
4438 Không tan Không tan
5408 Không tan Không tan
5722 Không tan Không tan
Từ số liệu ở bảng 4.4, có thể nhận thấy rằng oligomer OS đã thể hiện tính nhạy khi pH môi trường thay đổi (từ pH=12 sang pH=2), khi các mẫu OS đã tan ở pH=12 và không tan ở môi trường có pH=2. Hiện tượng này có thể được giải thích rằng, ở môi trường có pH cao (pH=12), nhóm sulfonamide đã bị ion hóa và cho đi H+, điều
85
giữa các mạch phân tử cũng tăng theo, lực liên kết này lớn đến mức các phân tử H2O không thể tấn công vào, tách các mạch phân tử ra và ion hóa các nhóm sulfonamide.
Đó là lý do tại sao OS có trọng lượng phân tử lớn (Mn=2907 trở lên) hoàn toàn không tan trong môi trường nước, trong tất cả các điều kiện pH khác nhau.
Đối với các OS thể hiện tính nhạy pH, khoảng nhạy pH được xác định là khoảng giá trị pH mà trong đó có thể quan sát được hiện tượng đề ion hóa của oligomer xảy ra.
Phương pháp xác định pKa của OS được mô tả cụ thể trong đồ thị ở Hình 4.16.
86
Hình 4.16. Xác định pKa của OS
Bảng 4.5. Các giá trị nhạy pH của OS tại các khối lượng phân tử khác nhau Mẫu Mn pH cận trên pH cận dưới pKa VHCl (0.1N) (ml)
9-1-2 2314 7.38 6.5 6.94 2.71
14-1-2 1455 7.87 6.45 7.16 1.62
14-1 2133 7.62 6.58 7.1 2.64
20-1-2 1230 8.51 6.07 7.29 1.53
20-1 1272 8.25 5.93 7.01 1.49
20-2 1442 7.92 6.43 7.17 1.67
20-3 1790 7.71 6.26 6.98 2.43
Có thể giải thích các sự tương quan giữa các giá trị độ nhạy pH và khối lượng phân tử trung bình trên dựa trên sự tăng lên của khối lượng phân tử trung bình. Khi khối lượng phân tử trung bình tăng lên thì số lượng nhóm chức có khả năng ion/đề ion hóa trên 1 mạch cũng tăng lên. Do vậy, mẫu có khối lượng phân tử lớn có giá trị
87
Hình 4.17. Sự thay đổi khả năng nhạy pH của OS theo Mn
Đối với mẫu có khối lượng phân tử nhỏ thì số lượng nhóm chức có khả năng ion/đề ion hóa trên 1 mạch ít, nên pH môi trường sẽ thay đổi nhanh hơn trong khoảng nhạy làm khoảng nhạy pH rộng hơn so với mẫu có khối lượng phân tử cao. Tương tự như vậy, đối với mẫu có khối lượng phân tử lớn thì cần thể tích HCl 0.1N nhiều hơn để thực hiện trao đổi proton với các nhóm chức nhạy cảm pH trên mạch oligomer.
88
Hình 4.18. Đường cong chuẩn độ của các mẫu OS
Bên cạnh đó, một yếu tố ảnh hưởng quan trọng đó là: sự gia tăng khối lượng phân tử của polymer sẽ làm khả năng phản ứng lại tác động môi trường của oligomer chậm chạp hơn vì phân tử mạch dài, áng ngữ không gian và cồng kềnh.
Qua khảo sát độ nhạy pH cho thấy, loại oligomer được tổng hợp từ mSerine có khả năng nhạy theo cơ chế nhạy anion. Với giá trị bắt đầu nhạy cao (từ 8.51 giảm 7.38 theo chiều tăng khối lượng phân tử) và điểm kết thúc nhạy sau giá trị pH máu (7.15-7.4) (từ 5.93 tăng đến 6.58) cho thấy loại oligomer này có khả năng ion hóa ở môi trường pH cao (10-11) và bị đề ion hóa khi đưa vào môi trường pH thấp (dưới 7).
Nhận xét: Từ các kết quả 1H-NMR, GPC, đường cong chuẩn độ, có thể kết luận rằng:
− mSerine có thể sử dụng để tổng hợp oligomer OS có chứa nhóm chức sulfonamide nhạy pH dựa vào các nhóm –COOH và –OH có trên phân tử mSerine.
89
qua đó có thể được áp dụng cho vật liệu y sinh nhạy pH dùng trong cơ thể người.
Vì vậy, mSerine sẽ được sử dụng để cộng hợp (conjugate) vào triblock nhạy nhiệt độ PCL-PEG-PCL để tạo thành pentablock nhạy pH/ nhiệt độ ứng dụng làm hệ vận chuyển thuốc (tỉ lệ mol mSerine/DCC/DMAP là 1/1/0.1 và tỉ lệ mSerine/DMF là 1/20 (w/v)).
4.3. Tổng hợp pentablock nhạy pH/nhiệt độ dựa trên triblock PCL-PEG-PCL và oligomer OS.
4.3.1. Xác định cấu trúc bằng phương pháp đo cộng hưởng từ proton 1H-NMR Phổ 1H-NMR được đo trên máy Bruker Avance ở 500MHz và được dùng để xác định cấu trúc phân tử của PCL-PEG-PCL và pentablock OC-PCL-PEG-PCL-OC dung môi là CDCl3 chứa 0,03%(v/v) Tetramethylsilane (TMS).
90
Hình 4.19. Phổ 1H-NMR của PCL-PEG-PCL (a), mSerine (b), pentablock OS-PCL- PEG-PCL-OS (c)
a)
b)
c)
91 cuối của ε-caprolactone (CL).
Thành phần cấu trúc của triblock copolymer thu được thông qua việc tính toán các peak trên phổ 1H-NMR cho biết tỉ lệ khối lượng giữa PCL và PEG phù hợp với mô tả trong các bài báo trước về đặc điểm cấu trúc của triblock copolymer PCL-PEG- PCL (PCL/PEG=1.8).
Kết quả phổ 1H-NMR của OS-PCL-PEG-PCL-OS (CDCl3, 500MHz) xuất hiện các peak đặc trưng của triblock copolymer nhạy nhiệt, đồng thời xuất hiện peak đặc trưng tách biệt tại: δ= 7-8ppm thể hiện vòng thơm trên mạch phân tử OS. Ngoài ra, peak đặc trưng cho H của nhóm methine (-CH-) trên mạch OS tại vị trí δ = 3.20.
Do vậy, có thể kết luận phản ứng “coupling” đã tạo được sản phẩm triblock copolymer nhạy nhiệt có gắn oligomer OS nhạy cảm pH.
Điều này được giải thích như sau: pentablock copolymer tạo thành tan tốt trong CHCl3, mà sản phẩm OS không tan trong dung môi này. Do đó có thể kết luận OS có phản ứng với triblock copolymer, nhờ vào khả năng hòa tan của mạch phân tử nhạy cảm nhiệt độ mà sản phẩm pentablock cũng mang tính chất đó. Theo đó, cấu trúc được xác định bởi phổ cộng hưởng từ hạt nhân cho thấy sản phẩm pentablock OS- PCL-PEG-PCL-OS được hình thành sau phản ứng.
92
Hình 4.20. Mẫu pentablock OS-PCL-PEG-PCL-OS được tổng hợp 4.3.2. Kết quả GPC pentablock OS-PCL-PEG-PCL-OS
Bảng 4.6. Khối lượng phân tử của các mẫu pentablock được tổng hợp
Mẫu PCL-PEG-PCL (Mn)a
PEG/PCL (w/w)a
Tỉ lệ mol
mSerine/triblock OS-PCL-PEG-PCL-OSb Mw/Mnb
1750-4 1575-1750-1575 1/1.8 4/1 348-1575-1750-1575-348 1.14
1750-8 1575-1750-1575 1/1.8 8/1 877-1575-1750-1575-877 1.31
1750-12 1575-1750-1575 1/1.8 12/1 1344-1575-1750-1575-1344 1.38
2050-4 1845-2050-1845 1/1.8 4/1 459-1845-2050-1845-459 1.18
2050-8 1845-2050-1845 1/1.8 8/1 858-1845-2050-1845-858 1.39
2050-12 1845-2050-1845 1/1.8 12/1 1330-1845-2050-1845-1330 1.38
aKhối lượng trung bình của PCL-PEG-PCL được tính từ phổ 1H-NMR.
bĐo bằng GPC.
93
Hình 4.21. Phổ GPC của mẫu 1750-4
Hình 4.22. Phổ GPC của mẫu 1750-8
Hình 4.23. Phổ GPC của mẫu 1750-12
94
Hình 4.24. Phổ GPC của mẫu 2050-4
Hình 4.25. Phổ GPC của mẫu 2050-8
Hình 4.26. Phổ GPC của mẫu 2050-12
95
nhiên và làm thay đổi khối lượng phân tử trung bình của sản phẩm sau cùng. Ngoài ra, trong quá trình phản ứng với hệ xúc tác DCC/DMAP, ngoài chiều hướng chính là cộng hợp mSerine vào triblock nhờ nhóm –COOH của mSerine và –OH của triblock, còn xảy ra phản ứng cạnh tranh là nhóm –COOH và –OH của mSerine tự phản ứng với nhau tạo thành oligomer OS. Từ đó xảy ra khả năng, oligomer OS tạo ra không gắn tiếp vào triblock mà tiếp tục phát triển mạch, khi phản ứng kết thúc sẽ bị loại bỏ qua quá trình lọc rửa.
Bên cạnh đó, độ đa phân tán của các mẫu pentablock được liệt kê trong bảng đều tăng so với độ đa phân tán của các mẫu triblock copolymer nhạy cảm nhiệt độ ban đầu. Ngoài ra, các sản phẩm triblock dư cũng góp phần làm tăng độ đa phân tán của sản phẩm polymer sau cùng.
4.3.3. Khảo sát quá trình chuyển pha sol-gel
Trạng thái chuyển pha sol (chảy) - gel (không chảy) của triblock copolymer trong môi trường nước được xác định bằng phương pháp thử nghiệm nghịch chuyển (Inverting test method) sử dụng 1 lọ nhỏ loại 10ml, đường kính lọ 10mm. Copolymer được hòa tan trong dung dịch đệm PBS với một nồng độ cho trước ở 100C và pH của mẫu được điều chỉnh bằng dung dịch HCl (5M). Dung dịch sau khi hòa tan hoàn toàn được giữ ổn định ở 00C trong vòng 1-2 ngày trước khi đem khảo sát. Sự chuyển pha sol-gel ở mỗi nhiệt độ được xác định bằng góc ngang của ống nghiệm sau khi giữ nó ở một nhiệt độ không đổi trong vòng 10 phút.
96
Hình 4.27. Quá trình chuyển pha sol-gel của pentablock: a) trạng thái sol; b) trạng thái gel; c) trạng thái vữa sol
Hình 4.28. Giản đồ chuyển pha sol-gel của các mẫu pentablock có cùng triblock (PEG 1750)
a) b)
c)
97
Hình 4.29. Giản đồ chuyển pha sol-gel của các mẫu pentablock có cùng triblock (PEG 2050)
Như đã trình bày, oligomer được tổng hợp để khảo sát trong đề tài này phải bị đề ion hóa (gel) ở giá trị pH của máu (7.15-7.4) để có thể bao bọc phần thuốc bên trong khi được tiêm vào cơ thể, và bị ion hóa ở pH 7.4 nhằm hòa tan được trong dung dịch trước khi sử dụng và có khả năng giải phóng thuốc.
Quá trình chuyển pha sol-gel của triblock PCL-PEG-PCL trong dung dịch chỉ phụ thuộc vào nhiệt độ. Nó được chia làm 3 vùng với các trạng thái khác nhau: trạng thái sol, gel và dạng vữa sol (sedimentation). Trong khi đó OS-PCL-PEG-PCL-OS thể hiện chuyển pha sol-gel với cả nhiệt độ và pH tại nồng độ 30wt% (Hình 4.27-28).
Có thể nhận thấy sự xuất hiện giá trị pH tới hạn (CGpH: là giá trị pH mà tại đó bắt đầu xảy ra quá trình gel hóa) và 2 nhiệt độ gel tới hạn (CGT): nhiệt độ gel tới hạn dưới (lCGT) và trên (uCGT) tại đường cong. Tại pH cao hơn pKa (pKa dao động trong khoảng 6.94-7.29), OS bị ion hóa và độ hòa tan trong dung dịch tăng. Do đó pentablock OS-PCL-PEG-PCL-OS ở trạng thái sol. Khi pH thấp hơn pKa của OS, khối OS bị đề ion hóa và trở nên kị nước và dung dịch có thể tồn tại ở trạng thái gel.
Điều này có thể được giải thích là do khi pH thấp hơn pKa OS thì khối OS bị đề ion
98
hóa nên PCL-OS đóng vai trò là khối kị nước ở pH thấp và nhiệt độ cao. Do đó, cân bằng kị nước/ưa nước (PCL-OS/PEG) chuyển sang kị nước hơn và giữa các khối polymer có khả năng hình thành tương tác kị nước nên pentablock OS-PCL-PEG- PCL-OS có thể hình thành cấu trúc micelle trong dung dịch ưa nước với PCL-OS là nhân và PEG là vỏ. Tại nồng độ thích hợp (cao hơn nồng độ gel tới hạn CGC) các micelle sẽ kết hợp với nhau bằng các cầu nối làm cho pentablock có thể tồn tại ở trạng thái gel. Do các cầu nối trong mạng hydrogel là liên kết vật lý nên cơ tính không cao.
Khi nhiệt độ tăng cao, các phân tử H2O trong mạng hydrogel dao động mạnh hơn và làm phá vỡ cấu trúc hydrogel, kết quả là pentablock chuyển sang trạng thái vữa sol.
Tại cùng một tỉ lệ PCL/PEG (Hình 4.28-29), sự thay đổi của block nhạy pH OS làm thay đổi giá trị pH tới hạn (CGpH) và nhiệt độ gel tới hạn dưới (lCGT). Với khối lượng phẩn lớn hơn, block OS khi bị ion hóa sẽ làm cho khối PCL-OS có tính kị nước cao hơn (do block kị nước dài hơn). Từ đó, cân bằng kị nước/ ưa nước (PCL-OS/PEG) trở nên kị nước hơn. Điều này làm tăng khả năng kết tụ của các block PCL-OS kị nước thành tâm core của micelles, kết quả là các cầu micelles dễ hình thành hơn và khối gel dễ tạo thành hơn ở nhiệt độ thấp hơn và trong môi trường pH cao hơn. Vì vậy giá trị CGpH tăng lên và lCGT giảm xuống (có nghĩa là vùng gel được mở rộng) khi khối lượng phân tử OS tăng lên.
99
Hình 4.30. Giản đồ chuyển pha sol-gel của pentablock sử dụng PEG 1750 (mẫu 1750-12) và PEG 2050 (mẫu 2050-12)
Khi thay thế PEG 1750 bằng PEG 2050 (Hình 4.30) thì vùng gel được nâng lên cao hơn. Điều này là do khi chiều dài đoạn PEG (ưa nước) tăng lên, tương tác giữa các nhóm kị nước và ưa nước trở nên mạnh hơn, cụ thể đoạn PEG dài hơn làm tăng sự ưa nước khiến dung dịch pentablock khó gel ở nhiệt độ thấp hơn và có cấu trúc gel bền vững hơn nên chịu được nhiệt độ cao hơn trước khi bị vữa ra do tác dụng của nhiệt từ đó mở rộng vùng gel.
Khi nhiệt độ được nâng lên trên 500C, tất cả các mẫu pentablock copolymer ở điều kiện pH khảo sát đều bị vữa ra. Hiện tượng này được giải thích dựa vào độ linh động cao của nước ở nhiệt độ cao. Sự chuyển động của các phân tử nước nhanh và mạnh ở nhiệt độ cao làm chúng thoát khỏi khối hydrogel và phá hủy cấu trúc hydrogel, nên gây hiện tượng vữa/rã.
100
Hình 4.31. Hình TEM của khối hydrogel ở trong vùng gel (x30k)
101
Hình 4.32. Hình TEM của khối hydrogel ở trong vùng gel (x200k)
Kết quả TEM ở Hình 4.31-32 cho thấy các micelle hình thành trong dung dịch và liên kết với nhau, tạo thành khối các micelle là tiền đề của sự hình thành hydrogel khi dung dịch polymer có nồng độ đủ cao. Có thể giải thích điều này dựa vào sự sắp xếp ngẫu nhiên của các phân tử pentablock copolymer, khi chúng ở gần nhau sẽ có hiện tượng một số mạch pentablock có PCL và OS đó vai trò là tâm core của 2 micelle khác nhau. Trong trường hợp này, các pentablock trở thành cầu nối không gian của các micelle. Ở nồng độ cao, sẽ hình thành mạng không gian ba chiều của hydrogel nhạy cảm nhiệt độ và pH.