CHƯƠNG 02: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.2. Thử nghiệm trong phòng thí nghiệm
2.1.2.1. Đánh giá sơ bộ khả năng sinh tổng hợp amylase, protease của một số chủng Bacillus sp.
- Đánh giá khả năng sinh tổng hợp amylase của các chủng Bacillus sp:
Để đánh giá khả năng sinh tổng hợp amylase của các chủng Bacillus sp chúng tôi sử dụng môi trường agar số 1 (phụ lục). Giống được trẻ hoá trước 24 giờ trên môi trường số 5 (phụ lục). Lượng giống cấy vào thành điểm với đường kính 2mm. Mỗi đĩa thạch cấy 3 chủng, và được lập lại 3 lần. Để vi sinh vật phát triển chúng tôi nuôi trong tủ ấm 30oC trong thời gian 72 giờ. Để xác định tinh bột được thủy giải chúng tôi dùng dung dịch lugol đổ lên đĩa và được đưa vào tủ ấm sau 30 phút tiến hành đo vòng thủy giải.
- Đánh giá khả năng sinh tổng hợp enzym protease của các chủng Bacillus sp:
Với cách làm tương tự như trên để xác định khả năng sinh protease của các chủng Bacillus sp chúng tôi sử dụng môi trường số 2 (phụ lục).
Các chủng vi khuẩn trước đó được hoạt hoá trên môi trường số 5. Các chủng vi khuẩn nuôi trên môi trường số 2 sau 3 ngày ở nhiệt độ 30oC được đưa ra để xác định khả năng thủy giải casein bằng dung dịch HgCl2.
2.1.2.2 Xác định ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh tổng hợp enzym amylase của các chủng Bacillus sp:
Để xác định ảnh hưởng của các pH môi trường đến khả năng sinh tổng hợp enzym amylase chúng tôi sử dụng môi trường số 1(phụ lục) với pH 7,8,9.
Phương pháp tiến hành trình bày trong mục (2.1.2.1.)
40
2.1.2.3. Xác định ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh tổng hợp enzym protease của các chủng Bacillus sp:
Để xác định ảnh hưởng của các pH môi trường đến khả năng tổng hợp enzym protease của các chủng Bacillus sp chúng tôi sử dụng môi trường cơ sở số 2 với pH thay đổi =7,8,9.
Phương pháp tiến hành như mục (2.1.2.2.)
2.1.2.4. Xác định hoạt tính emzyme amylase theo phương pháp Smith và Roe (1966).
Dùng các ống nghiệm có đánh dấu sẵn và lần lượt cho vào các ống nghiệm các dịch và hoá chất như sau:
Ống chuẩn Ống thử
1ml H2O cất 1 ml dịch enzym các mẫu
1ml đệm phosphat 1/15 M(pH 5,6 đối với amylase nấm mốc và 6,5 đối với vi khuẩn)
1ml đệm phosphat 1/15 M(pH 5,6 đối với amylase nấm mốc và 6,2 đối với vi khuẩn)
1ml hồ tinh bột 1% 1ml hồ tinh bột 1%
0,5ml NaCl 3% 0,5ml NaCl 3%
1ml HCl 1N
Tất cả đem ủ ở 400C trong 30 phút, sau đó ở các ống thử cho vào mỗi ống 1ml HCl 1N để kìm hãm ngay sự hoạt động enzym. Tiếp theo thêm nước cất cho đủ mỗi ống 10ml, và mỗi ống 1 giọt lugol 1%.
Đem đo mật độ quang ở bước sóng = 600nm
41 Đơn vị hoạt tính được tính theo công thức:
IU =(E0 -EK).C.L E0.t Trong đó:
E0 : mật độ quang học của ống chuẩn EK : mật độ quang học của ống thử
C : lượng tinh bột ban đầu tham gia phản ứng L : hệ số pha loãng
t : thời gian phản ứng
2.1.2.5. Xác định hoạt tính enzyme protease theo phương pháp Anson.
Nguyên tắc:
Protein (casein, hemoglobin) bị thuỷ phân dưới tác dụng của enzym protease. Sản phẩm là các đoạn peptit ngắn hoà tan trong axit tricloacetic (TCA) và một số các axit amin. Các peptit và sản phẩm tạo thành có chứa tyrosin, trytophan khi cho tác dụng với thuốc thử Folin tạo dung dịch có màu. Cường độ màu tăng tỷ lệ với chất đem phản ứng, cường độ màu được ghi nhận bằng giá trị mật độ quang OD ở = 660nm.
Phản ứng thuỷ phân liên kết peptid theo dạng tổng quát sau:
R – CH – CO – NH – CH – R’ + H2O R – CH –COOH + H2N –CH – R’
NH2 COOH NH2 COOH Liên kết peptid
Hoá chất:
- Dung dịch NaOH 0,5N – 1N - Dung dịch HCl 0,2N – 2N
42
- Dung dịch đệm phosphat (1/15 M; pH 7,6): trộn dung dịch KH2PO4
1/15M với Na2HPO4 theo tỷ lệ nhất định để tạo dung dịch có pH = 7,6.
- Dung dịch casein 1%: cân 1g casein hoà tan trong 100ml dung dịch đệm phosphat pH = 7,6 đun cách thuỷ đến khi casein tan hoàn toàn định mức lại nước cất thành 100ml, bảo quản tủ lạnh.
- Dung dịch hemoglobin 1%: cân 1gam hemoglobin + 18gam Ure + 4ml dung dịch NaOH 1M hoà tan trong 20ml nước cất. Để ở 250C trong 60 phút, thêm 5ml dung dịch đệm KH2PO4 1M, điều chỉnh lại pH = 6 với dung dịch HCl 2M, thêm nước tới vạch mức 100ml, bảo quản trong tủ lạnh.
- Dung dịch albumin 1%: cân 1g albumin hoà tan trong nước cất. Sau đó định mức thành 100ml. Bảo quản tủ lạnh.
- Dung dịch TCA 5%
- Thuốc thử Folin được pha theo phương pháp đã trình bày trong tài liệu.
Trước khi dùng pha loãng với nước cất theo tỷ lệ 1:3
- Dung dịch Tyrosin chuẩn 1M: cân 18, 119 mg Tyrosin hoà tan trong HCl 0,2M thành 100ml.
Thí nghiệm:
Dựng đường chuẩn Tyrosin: để xác định lượng Tyrosin trong dung dịch nghiên cứu ta cần dựng đường chuẩn Tyrosin. Trình tự tiến hành theo bảng sau:
Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5
Dung dịch Tyrosin chuẩn (ml) 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Lượng Tyrosin tương ứng 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
HCl 0.2N (ml) 2.5 2.4 2.3 2.2 2.1 2.0
NaOH 0.5N (ml) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 Folin (1:3) (ml) 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
43
Lắc mạnh sau 5 đến 10 phút, đo OD ở bước sóng = 660 nm. Ống 0 là ống kiểm chứng (KC), các ống còn lại là các ống thí nghiệm (TN).
Từ kết quả trên thu được ta vẽ đường chuẩn Tyrosin biểu diễn sự tương quan giữa lượng Tyrosin (M) và OD = ODTN - ODKC
Xác định lượng Tyrosin trong dung dịch nghiên cứu:
Dùng hai ống nghiệm A và B cho vào mỗi ống 1 ml dung dịch cơ chất là casein 1% hay hemoglobin 1% giữ ở nhiệt độ 35oC.
Cho vào ống A 1 ml dung dịch enzym, lắc đều và giữ ở nhiệt độ 35oC chính xác 20 phút. Sau đó thêm vào 30 ml dung dịch TCA 5%.
Ống B là ống kiểm chứng, thực hiện như ống A nhưng cho 3 ml dung dịch TCA 5% vào cùng với dung dịch cơ chất trên và dung dịch enzym.
Sau khi cho TCA vào xong, để yên 30 phút rồi đem lọc kết tủa, lấy 1ml dịch lọc, thêm 2ml NaOH 0.5 và 0.6 ml thuốc thử Folin (đã pha loãng 1:3). Lắc mạnh sau 5-10 phút, đo mật độ quang (OD) ở cả 2 ống A và B ở bước sóng =660 nm.
Tính OD =ODA - ODB, dựa vào đồ thị chuẩn suy ra lượng Tyrosin tương ứng.
* Cách tính:
Định nghĩa đơn vị Anson: một đơn vị Anson là một lượng enzym tối thiểu trong điều kiện chuẩn về pH, nhiệt độ…thuỷ phân casein (hay hemoglobin) ở nhiệt độ 35oC trong một phút tạo thành sản phẩm hoà tan trong TCA và khi phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD ở bước sóng =660 nm .
Công thức tính: số đơn vị hoạt tính protease ở nhiệt độ 35oC theo công thức:
MolTyr. V Hoạt tính protea/gam (ml) chế phẩm E = ___________
v.t.m (v’) Với:
44
V: thể tích toàn bộ dung dịch A hay B (ml) v: thể tích dung dịch đem đi xác định (ml)
v’: thể tích enzym đem đi xác định hoạt tính (ml) m: khối lượng enzym đem xác định hoạt tính (gam) t: thời gian thuỷ phân (phút)