Xác định khả năng sinh tổng hợp emzyme của các chủng vi sinh

3.1. CHỌN LỌC CÁC CHỦNG BACILLUS SP SỬ DỤNG TRONG NUÔI TÔM

3.1.2. Xác định khả năng sinh tổng hợp emzyme của các chủng vi sinh

3.1.2.1. Xác định khả sinh tổng hợp amylase của các chủng Bacillus sp:

Nhằm tìm hiểu khả năng sinh tổng hợp enzym amylase của các chủng Bacillus sp sử dụng trong nuôi tôm sú. Chúng tôi đã kiểm tra 16 chủng vi khuẩn Bacillus sp trên môi trường tinh bột hòa tan. Kết quả trình bày ở (Hình 3.1) cho thấy tất cả các chủng đều mọc tốt, đường kính khuẩn lạc sau 3 ngày nuôi cấy đạt 10-20mm. Đường kính vòng phân giải thấp nhất là 12mm và cao nhất là 30mm, tỷ lệ giữa đường kính vòng phân giải so với khuẩn lạc thấp nhất là 1,08 ở chủng 9.1 và cao là 1,76 ở chủng 2.2.

Căn cứ vào tỷ lệ đường kính vòng phân giải và đường kính khuẩn lạc chúng tôi chọn ra một số chủng có khả năng sinh tổng hợp cao để nghiên cứu tiếp theo là 2.2, 11.4, 4.5, 4.7, 4.6, 10.2.

Hình 3.1: Khả năng sinh tổng hợp amylase của các chủng Bacillus sp

32 L23 Lactobacillus sp +

0 5 10 15 20 25 30 35

1.1 1.3 1.4 2.2 4.5 4.6 4.7 6.3 6.5 8.3 9.1 10.1 10.2

11.4 12.1

13.1 Các chủng vi khuẩn

Đươứng kớnnh khuẩn laùc hoặc vũng phõn giaỷi, (mm)

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2

Tyỷ leọ D vũng phõn giaỷi/ d khuaồn laùc

d (mm) D (mm) D/d

54

3.1.2.2. Khả năng sinh tổng hợp emzym protease của các chủng Bacillus sp sử dụng trong nuôi tôm:

Thức ăn nuôi tôm chứa hàm lượng protein rất cao trên 40%, vì vậy các chất thải trong môi trường nuôi tôm rất giầu protein, nên việc tìm ra những chủng vi sinh vật có khả năng phân giải protein cao, cũng như các chủng vi sinh vật nitrate hoá để biến Amonia (NH3+-N) thành nitrate là mục tiêu của nhiều nghiên cứu. Mục đích nghiên cứu này của chúng tôi nhằm tìm một số các chủng Bacillus sp có khả năng sinh tổng hợp cao protease. Thí nghiệm được thực hiện trên môi trường với cơ chất là casein. Kết quả thí nhiệm trình bày ở Hình 3.2.

Hình 3.2: Khả năng sinh tổng hợp protease của các chủng Bacillus sp Qua Hình 3.2 cho thấy tất cả các chủng thử nghiệm đều có vòng phân giải casein lớn hơn đường kính khuẩn lạc, điều đó chứng tỏ rằng các chủng đều có sinh tổng hợp protease. Căn cứ vào tỷ lệ của đường kính vòng thủy giải casein với đường kính khuẩn lạc chúng tôi đã chọn ra 06 chủng: 2.2, 11.4, 10.2, 1.4, 4.6, 4.7. Kết quả trên hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu của Sangeetha et al. (2008). Trong khi đó, Mussarat et al.

(2008) cho rằng casein là nguồn nitơ kích thích khả năng sinh tổng hợp protease.

55

3.1.2.3. Ảnh hưởng pH môi trường đến khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase của các chủng Bacillus sử dụng trong nuôi tôm sú:

pH môi trường là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzym amylase của vi sinh vật. Để tìm hiểu mối liên quan giữa pH của môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp của các chủng amylase trong nuôi tôm sú, chúng tôi thực hiện trên môi trường có tinh bột với các pH khác nhau là 7, 8, 9 kết quả trình bày ở Hình 3.3.

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2

1.1 1.3 1.4 2.2 4.5 4.7 6.3 6.5 6.6 8.3 9.1 10.1 10.2 11.4 12.1 13.1

Tyỷ leọ D/d

Các chủng Bacillus

pH 7 pH 8 pH 9

Hình 3.3: Ảnh hưởng pH đến khả năng sinh tổng hợp amylase.

- Khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase của các chủng Bacillus sp trên 3 môi trường có pH khác nhau là:7, 8, 9 thì khác nhau không nhiều.

- Phần lớn các chủng có khả năng sinh tổng hợp cao ở pH = 8 như ở chủng 1.4, 2.2, 4.5, 6.3, 6.6, 8.3, 11.4.

- Một số chủng sinh tổng hợp amylase cao trên pH môi trường bằng 9 (trước khi thanh trùng) như: 4.7, 6.5, 9.1, 10.2, 11.4, 12.1.

- Chỉ có một số chủng sinh tổng hợp amylase cao ở pH = 7 như các chủng 1.1, 1.3.

56

3.1.2.4. Ảnh hưởng pH môi trường đến khả năng sinh tổng hợp enzym protease của các chủng Bacillus sp:

Nghiên cứu tiếp theo của chúng tôi là xác định ảnh hưởng của pH môi trường đến khả năng sinh tổng hợp protease. Thí nghiệm thực hiện trên môi trường agar với cơ chất là casein. pH môi trường được điều chỉnh bằng 7, 8, 9. Các vi khuẩn thử nghiệm được cấy vào đĩa với đường kính ban đầu là 1mm, sau 72 giờ nuôi ở nhiệt độ 30oC, sau đó xác định vòng phân giải bằng dung dịch HgCl2. Kết quả được trình bày ở Hình 3.4.

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

1.1 1.3 1.4 2.2 4.5 4.6 4.7 6.3 6.5 8.3 9.1 10.1 10.2 11.4 12.1 13.1

Tyỷ leọ D/d

Các chủng Bacillus

pH 7 pH 8 pH 9

Hình 3.4. Hoạt lực enzym protease của các chủng Bacillus sp.

- Khả năng sinh tổng hợp protease của các chủng Bacillus sp thử nghiệm không khác nhau nhiều trên 3 môi trường pH=7, 8, 9.

- Một vài chủng sinh tổng hợp protease cao ở pH=7 như :2.2, 11.4, 12.1.

- Một số chủng sinh tổng hợp protease cao ở pH=8 như :1.3, 1.4, 4.7 và 13.1.

57

- Một số chủng có khả năng sinh tổng hợp cao ở pH=9 như: 1.1, 4.6, 6.3, 8.3, 10.2, 11.4.

3.1.2.5. Xác định hoạt tính amylase của chủng Bacillus sp:

Sau thí nghiệm sơ bộ chúng tôi tiến hành nghiên cứu xác định hoạt tính amylase của một số chủng Bacillus sp. Hoạt tính xác định theo phương pháp Smith và Roe (1946). Kết quả thí nghiệm trình bày ở Hình 3.5.

Hình 3.5: Hoạt lực enzym amylase của chủng Bacillus sp

- Trong số 8 chủng Bacillus sp nghiên cứu, chủng có hoạt tính amylase mạnh nhất là chủng 2.2 (17,25UI/ml) tiếp theo là các chủng 11.4 (16,15UI/ml), 10.2 (14,36UI/ml), 4.5 (12,3UI/ml), 4.7 (12,11UI/ml), 1.3 (10,5UI/ml), 4.6 (10,15UI/ml) và thấp nhất là chủng 1.1 (6,18UI/ml).

- Các chủng khi xác định sơ bộ bằng vòng phân giải tinh bột cao, đồng thời là các chủng có hoạt lực amylase cao, các khuẩn lạc có khả năng phân hủy tinh bột (Amy+ ) tạo ra một vòng sáng rộng xung quanh khuẩn lạc và vòng sáng này không cho phản ứng màu với dung dịch Iod. Sự hiện diện của vòng halo thủy phân tinh bột bao quanh khuẩn lạc có thể sử dụng để đánh giá sơ bộ khả năng thủy phân tinh bột của các dòng vi khuẩn.

58

3.1.2.6. Hoạt tính enzym protease của một số chủng Bacillus sp:

Để xác định hoạt tính protease của 8 chủng Bacillus sp chúng tôi đã nuôi cấy trên môi trường có nguồn protein là casein. Hoạt tính enzym protease theo phương pháp Anson. Kết quả được trình bày ở Hình 3.6.

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

2.2 4.5 4.6 4.7 1.1 1.3 11.4 10.2

Hoạt tính Protease (UI/ml)

Các chủng vi khuẩn Bacillus

Hình 3.6: Hoạt lực emzyme protease của chủng Bacillus sp

- Hoạt tính protease của 8 chủng Bacillus sp nghiên cứu, chủng có hoạt tính mạnh nhất là chủng 2.2 (40,2UI/ml) tiếp theo là các chủng 11.4 (35,28UI/ml), 1.3 (32,15UI/ml), 4.7 (30,25UI/ml), 4.6 (25,21UI/ml), 10.2 (15,26UI/ml), 1.1 (15,24UI/ml) và thấp nhất là chủng 4.5 (10,03UI/ml).

- Hai chủng 2.2 và 11.4 là những chủng cho hoạt tính amylase cao đồng thời là những chủng cho hoạt tính protease cao. Hai chủng 10.2 và 4.5 là những chủng có hoạt tính amylase cao nhưng hoạt tính protease thấp.

Chủng 4.6 có hoạt tính amylase thấp nhưng hoạt tính protease cao. Chủng 1.1 vừa có hoạt tính protease, amylase thấp. Thức ăn nuôi tôm chứa hàm lượng protein rất cao trên 40%, vì vậy các chất thải trong môi trường nuôi tôm rất giầu protein, nên việc tìm ra những chủng vi sinh vật có khả năng phân giải protein cao, cũng như các chủng vi sinh vật nitrate hoá để biến Amonia (NH3+-N) thành nitrate là mục tiêu của nhiều nghiên cứu.

59