Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp lấy mẫu và phân lập các chủng vi khuẩn chuyển hóa lưu huỳnh
2.3.1.2. Phương pháp phân lập
Môi trường thạch Beijeninck được hấp ở 1210C trong 15 phút.
Lấy 1 ít sinh khối từ ống nghiệm chứa môi trường chứa mẫu cấy ria lên thạch đĩa Beijeninck. Sau đó ủ ở 30oC trong 72 giờ.
Quan sát nhìn dạng khuẩn lạc phát triển, tiếp tục chọn những khuẩn lạc có hình dáng đặc trưng cấy chuyển vào môi trường thạch Beijeninck..
+ Tăng sinh vi khuẩn chuyển hóa lưu huỳnh
Môi trường lỏng Beijeninck chứa bình erlen được hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút.
Dùng que cấy vòng chạm lấy 1 ít sinh khối sau đó cấy vào môi trường lỏng Beijeninck.
Tiến hành nuôi cấy lắc ở nhiệt độ phòng 200 vòng trong 24giờ.
Xác định mật độ vi khuẩn trong dịch tăng sinh bằng phương pháp đếm khuẩn lạc mọc trên môi trường Beijeninck theo phương pháp cấy trang.
+Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn chuyển hóa lưu huỳnh trong môi trường lỏng Chuẩn bị môi trường : Môi trường lên men lỏng được chứa trong các ống nghiệm được hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút.
Vi khuẩn được tăng sinh sau đó hút 1ml dịch tăng sinh cho vào các ống nghiệm chứa 9ml môi trường Beijeninck.
Tiến hành nuôi cấy lắc ở nhiệt độ phòng 200 vòng trong 24giờ.
24
+Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn chuyển hóa lưu huỳnh trong môi trường rắn Chuẩn bị môi trường : Môi trường thạch Beijeninck hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Để nguội tiến hành đổ đĩa.
Vi khuẩn được tăng sinh sau đó dùng que cấy lấy sinh khối trong dịch tăng sinh cấy ria vào các đĩa chứa môi trường thạch Beijeninck.
+Phương pháp Nhuộm gram [3],[7]
Dựa vào khả năng bắt màu khác nhau của vi khuẩn gram (+) và gram (-) được quy định bởi vách tế bào để tiến hành nhuộm gram.
Nhuộm Gram (phương pháp Hucker cải tiến) Vật liệu, hoá chất:
Dung dịch Tím kết tinh (Crystal violet):
2g tím kết tinh hoà tan trong 20 ml ethanol 95%
0,8 g ammon oxalat hoà tan trong 80 ml nước cất
Trộn hai dịch nói trên lại với nhau, giữ 48 giờ rồi lọc. Bảo quản trong lọ tối, sử dụng vài tháng.
Dung dịch Iod:
Hoà tan 1 g Iod (Iodine) trong 3-5ml nước cất, thêm 2g KI (Kali iodide), khuấy cho tan hết, thêm nước cất cho đủ 300ml. Bảo quản trong lọ tối.
Dung dịch tẩy màu:
Etanol 95% hoặc trộn hỗn hợp 70ml ethanol 95% với 30ml aceton.
Dung dịch nhuộm bổ sung:
Chuẩn bị sẵn dung dịch Safranin O 2,5%, trước khi dùng pha với nước cất theo tỷ lệ 1:5 (vol/vol) để có dung dịch 0,5%.
Các bước tiến hành:
25
Chuẩn bị vết bôi: dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ thạch (sau khi cấy 24 giờ) hoà vào 1 giọt nước cất ở giữa phiến kính, làm khô trong không khí.
Cố định tế bào: hơ nhanh vết bôi trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần.
Nhuộm bằng dung dịch Tím kết tinh trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.
Nhuộm lại bằng dung dịch Iod trong 1 phút, rửa nước, thấm khô.
Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước, thấm khô.
Nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranin trong 2-3 phút, rửa nước, để khô trong không khí.
Soi kính: dùng vật kính dầu 100X.
Kết quả:
Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (－) bắt màu đỏ.
+Phương pháp kiểm tra sự thay đổi pH
Chuẩn bị môi trường : Môi trường lỏng Beijeninck trong các ống nghiệm hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút.
26
Dùng que cấy lấy sinh khối từ môi trường tăng sinh trước đó cấy vào các ống nghiệm môi trường đã chuẩn bị sẵn.
Quan sát sự thay đổi màu của dung dịch trong 15 ngày nuôi lắc.
+Phương pháp kiểm tra khả năng sử dụng glucose của các chủng vi khuẩn.
Chuẩn bị môi trường : Môi trường thạch Beijeninck có bổ sung 5g/l đường glucose hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút, để nguội tiến hành đỗ đĩa.
Dùng que cấy lấy sinh khối từ môi trường tăng sinh trước đó cấy vào các đĩa môi trường đã chuẩn bị sẵn.
Quan sát sự thay đổi màu của đĩa trong 72h nuôi cấy.
+Phương pháp kiểm tra khả năng sử dụng nguồn lưu huỳnh của các chủng vi khuẩn.
Chuẩn bị môi trường : Môi trường thạch Beijeninck có bổ sung 5g/l Na2S2O3 và hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút, để nguội tiến hành đỗ đĩa.
Dùng que cấy lấy sinh khối từ môi trường tăng sinh trước đó cấy vào các đĩa môi trường đã chuẩn bị sẵn.
Quan sát sự thay đổi màu của đĩa trong 72h nuôi cấy.
+Phương pháp kiểm tra tính di đông trên môi trường thạch mềm.
Chuẩn bị môi trường : Môi trường thạch Beijeninck (0,3% agar) hấp khử trùng ở 121oC trong 15 phút
Dùng đầu que cấy chọc thẳng vào môi trường, thận trong di chuyển đầu que cấy trên 1 đường. Ủ môi trường nuôi cấy ở 300C
Các vi khuẩn không di động là do không có lông roi, chỉ phát triển ở trong đường cấy và xung quanh môi trường trong. Các vi sinh vật di động, đã sử dụng lông roi để di chuyển ra ngoài của đường cấy và xuất hiện mờ khói trong môi trường. Lượng
27
thạch trong môi trường thấp (0,3-0,5%) làm cho môi trường không lỏng, không cứng để cho phép phát hiện di động tốt nhất.