Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Kết quả lấy mẫu và phân lập các chủng vi khuẩn chuyển hóa lưu huỳnh
3.1.1. Kết quả lấy mẫu
Bảng 3.1. Địa điểm lấy mẫu tại Phân Viện Chăn nuôi Nam Bộ.
STT Mô tả Ký hiệu
chủng
Ghi chú 1
Nước thải ngay tại đường ống ra sau khi đã xử lý Bio gas
2
Nước thải ở ngoài đường ống ra sau khi đã xử lý Bio gas
3 Bùn ở sau vùng nước thải khi đã qua xử lý Bio gas 4 Phân ướt từ chuồng ra (có thể đã lên men) 5 Phân khô, phân cũ (có thể đã lên men) 6 Nước ở đường ống từ các chuồng chảy ra 7 Bùn ở đường ống từ các chuồng chảy ra TH7
8 Nước thải từ heo con sau cai sữa TH8
9 Phân tươi từ heo con sau cai sữa
10 Nước thải từ chuồng heo sinh sản
11 Nước thải từ chuồng heo nái chửa TH11
12 Phân tươi từ chuồng heo nái chửa
13 Phân tươi từ chuồng heo nái (nuôi con) 14 Nước thải từ chuồng heo nái (nuôi con) TH14
15 Nước thải từ chuồng heo thịt
16 Phân tươi của gà giống (gà mái đẻ)
17 Phân tươi của gà giống (gà mái đẻ)
18 Nước thải từ chuồng gà giống
19 Phân tươi của gà thịt
20 Phân tươi của gà thịt
Nhận Xét : Trong 20 mẫu phân lập, có bốn mẫu (mẫu số 7, 8, 11 và 14) sau 72h nuôi cấy cho các khuẩn lạc tròn màu trắng, hóa nâu khi già giống như đặc điểm vi khuẩn Thiobacillus theo bảng phân loại Bergey trên môi trường Beijeninck thạch.
Sau đó, các chủng vi khuẩn trên được ký hiệu TH7, TH8, TH11 và TH14.
33
Hình 3.1: Khuẩn lạc trên môi trường thạch Beijeninck 3.1.2. Kết quả phân lập
Kết quả nhuộm Gram
Hình 3.2: Hình ảnh nhuộm Gram chủng TH8 vật kính 100X
34
Hình 3.3: Hình nhuộm Gram chủng TH7 ở vật kính 100X
Nhận xét: Kết quả nhuộm gram cho thấy vi khuẩn bắt màu hồng Gram (-) có hỡnh que ngắn kớch thước 0,3 x 1-3 àm, kết quả này phự hợp với những đặc điểm của chủng vi khuẩn Thiobacillus.
Kết luận: Kết quả nhuộm Gram cho thấy các chủng vi khuẩn phân lập được nghi ngờ thuộc chi Thiobacillus. Tiếp tục tiến hành các thử nghiệm sinh hóa test hoạt tính của các chủng để khẳng định tên chủng vi khuẩn.
35
Kết quả Sự thay đổi pH trong môi trường lỏng có chứa Bromocresol pupple.
Hình 3.4: Sự thay đổi pH trong môi trường Thiosulphate broth
Nhận Xét: Các chủng vi khuẩn phân lập được có khả năng làm thay đổi pH trong môi trường Thiosulphate broth.
Kết quả khảo sát sử dụng glucose của các chủng vi khuẩn.
Hình 3.5: Sự phát triển của vi khuẩn trên môi trường có bổ sung glucose.
36
Nhận xét: Các chủng vi khuẩn phân lập được có khả năng sử dụng glucose.
Kết quả kiểm tra khả năng sử dụng nguồn cơ chất.
Hình 3.6: Hình mẫu đối chứng khả năng sử dụng Na2S2O3
\
Hình 3.7: Khả năng sử dụng Na2S2O3 của các chủng vi khuẩn Nhận xét: Các chủng vi khuẩn phân lập được sử dụng Na2S2O3 như nguồn cơ chất.
37
Kết quả khảo sát khả năng di động
Hình 3.8: Khả năng di động
Nhận xét: các chủng vi khuẩn phân lập được có khả năng di động.
Kết quả tiến hành nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh hóa của một số chủng vi khuẩn sulffate hoá phân lập được được tóm tắt và được trình bày ở bảng.
Bảng 3.2. Đặc điểm hình thái, sinh hóa của một số chủng vi khuẩn Ký
Hiệu
Hình dạng
tế bào Di
Động
Gram
Sử dụng Màu sắc
khuẩn lạc
Kiểu dinh dưỡng Lưu
huỳnh
Thio- sulphate
Glucose
TH7 Trực khuẩn ngắn
+ - + + +
Tròn, màu vàng
rơm
Dị dưỡng
TH8 Trực khuẩn + - + + +
TH11 Trực khuẩn + - - + +
TH14 Trực khuẩn + - + + +
Nhận Xét: Khuẩn lạc mịn ,tròn và màu vàng rơm trong môi trường có bổ xung Bromocresol purple có lẽ là do sự lắng đọng lưu huỳnh. Giống kết quả đã được báo cáo cáo bởi một số nhà nghiên cứu Kelly, A.P.Harrison (1988), T.Kanagawa
38
(1995), Waksman, J.S.Joffe (1922), người đã phân lập được vi khuẩn chuyển hóa lưu huỳnh từ đất, phân vi khuẩn có hình que ngắn và hình thái tương tự như Thiobacillus. Các chủng vi khuẩn làm giảm độ pH và sử dụng cả hai nguyên tố lưu huỳnh và thiosulphate Waksman, J.S.Joffe (1922). Tất cả các chủng phân lập ở trên được phù hợp với kết quả của Kelly và Harrison.
Kết luận: Dựa trên các hình thái và các nghiên cứu sinh lý học tất cả 4 mẫu phân lập được bước đầu xác nhận thuộc về các chi Thiobacillus. Tiếp tục tiến hành khảo sát hoạt tính sunfat hóa của các chủng vi khuẩn phân lập được
3.2.1. Kết quả khảo sát hoạt tính sunfat hóa
Kết quả định tính hoạt tính sunfat hóa
Hình 3.9: Kết quả định tính sunfat của các chủng vi khuẩn.
ĐC TH7 TH8 TH11 TH14
39
Kết quả định lượng hàm lượng sunfua (hoạt tính sunfat hóa).
Hình 3.10: Hình trước và sau khi chuẩn độ chủng TH7
Hình 3.11: Hình trước và sau chuẩn độ chủng TH8 Bảng 3.3. Kết quả định lượng SO42-
Chủng Hàm lượng SO42-
TH7 113 ± 2,08a
TH8 84,81 ± 0,30b
TH11 52,27 ± 1,10c
TH14 36,34 ± 1,20d
40
Hình 3.12: Đồ thị khảo sát hoạt tính sunphat hóa của 4 chủng vi khuẩn.
Nhận Xét: Từ bảng và đồ thị kết hợp xử lý thống kê chúng tôi nhận thấy hoạt tính sunfat của 4 chủng vi khuẩn lưu huỳnh phân lập được có sự khác biệt rõ rệt. Chủng TH7 (hàm lượng trung bình SO42- là 113 mg/ml ) và TH8 (hàm lượng trung bình SO42- là 84,4 mg/ml ) có hoạt tính cao hơn hai chủng còn lại là TH11, TH14 trong cùng điều kiện môi trường thời gian nuôi cấy
Kết Luận: Vì mục tiêu của đề tài là phân lập được chủng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa lưu huỳnh cao, sử dụng cho đệm lót sinh học trong chăn nuôi heo, gà.
Dựa vào khả năng sunfat hóa, chúng tôi quyết định chọn chủng vi khuẩn TH7 có hoạt tính cao để tiếp tục khảo sát các yếu tố ảnh hưởng khác như môi trường, pH, nhiệt độ, nồng độ muối, nguồn cơ chất.
0 20 40 60 80 100 120 140
TH7 TH8 TH11 TH14
Hàm lượng SO42- (mg/ml)
Hàm lượng SO42- mg/ml
Chủng Vi khuẩn
41
3.2. Kết quả khảo sát môi trường, pH, nhiệt độ, nồng độ muối, nguồn cơ chất, thời gian thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn chuyển hóa lưu huỳnh.
3.3.1 Kết quả khảo sát môi trường tối ưu cho chủng TH7 Bảng 3.4. Kết quả khảo sát môi trường tối ưu cho chủng TH7
MT OD ( 600nm)
MT1 0,46 ±0,12a
MT2 0,14 ±0,04b
MT3 0,133±0,02c
MT4 0,01± 0,004d
MT5 0,06± 0,01e
Hình 3.13: Đồ thị kết quả khảo sát môi trường tối ưu cho chủng TH7 Nhận xét: Dựa vào kết quả ở bảng và đồ thị kết hợp xử lý thống kê ta thấy chủng TH7 đều có khả năng sinh trưởng và phát triển trong 5 môi trường khảo sát.
Tuy nhiên kết quả đo OD 600 nm cho thấy chủng TH7 phát triển thích hợp nhất với môi trường 1 (môi trường Bejienick) và sai khác có ý nghĩa so với 4 môi trường còn
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7
MT1 MT2 MT3 MT4 MT5
OD 600 nm
môi trường
Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy
42
lại. Chứng tỏ rằng môi trường 1 có tỷ lệ thành phần chất dinh dưỡng phù hợp nhất cho sự sinh trưởng phát triển của chủng TH7.
Kết luận: Môi trường MT1(Bejienick) là môi trường lỏng tối ưu nhất cho khả năng sinh trưởng và phát triển của chủng TH7.
3.3.2 Kết quả khảo sát pH thích hợp cho chủng TH7
Bảng 3.5. Bảng kết quả khảo sát pH thích hợp cho chủng TH7.
pH OD (600 nm)
pH4 0,111 ± 0,002d
pH5 0,165 ± 0,009b
pH6 0,219 ± 0,013a
pH7 0,137 ± 0,003c
pH8 0,147 ± 0,005c
pH9 0,097 ±0,001e
43
Hình 3.14: Đồ Thị kết quả khảo sát pH thích hợp cho chủng TH7
Nhận Xét: Qua bảng và đồ thị kết hợp với xử lý thống kê, chúng tôi nhận thấy chủng TH7 có khả năng phát triển trong môi trường có pH từ 4 đến 9.
Tuy nhiên ở pH=6 kết quả đo OD 600 nm cho thấy chủng TH7 có mật độ cao hơn (0,219) và sai khác có ý nghĩa so với các nồng độ pH khác. Trong khi đó ở pH=7 sai khác không có ý nghĩa với pH=8, ở pH=9 mật độ vi khuẩn đo được (0,097) thấp hơn so với ở các mức pH khác. Qua đó cho thấy ở pH=6 là pH tối ưu cho sự phát triển của chủng TH7.
Kết luận: pH tối ưu cho chủng TH7 qua khảo sát là pH=6 3.3.3 Kết quả khảo sát nhiệt độ thích hợp.
Bảng 3.6. Bảng Kết quả khảo sát nhiệt độ thích hợp.
Nhiệt Độ 30oC 35oC 40oC
OD (600nm) 0,156 ± 0,003a 0,142 ± 0,003b 0,093 ± 0,013c
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25
pH4 pH5 pH6 pH7 pH8 pH9
OD 600 nm
pH
Ảnh hưởng của pH
TH7
44
Hình 3.15: Đồ thị kết quả khảo sát nhiệt độ thích hợp.
Nhận Xét: Do điều kiện trang thiết bị hạn chế cùng với tham khảo tài liệu của một số nghiên cứu trước nên chúng tôi chỉ khảo sát ở ba mức nhiệt độ là 30oC, 35oC, 40oC. Qua Bảng và Đồ thị cùng với xử lý thông kê chúng tôi nhận thấy ở mức nhiệt độ 30oC sau khi nuôi cấy và đo OD 600 nm mật độ vi khuẩn đạt 0,156 cao hơn ở hai mức nhiệt độ 35oC (0,142), 40oC (0,093) và sai khác có ý nghĩa thống kê. Chứng tỏ rằng ở nhiệt độ 30oC trong dãy nhiệt độ khảo sát là nhiệt độ thích hợp hơn cho sự phát triển của chủng TH7.
Kết luận: Nhiệt độ thích hợp cho chủng TH7 là 30oC.
3.3.4 Kết quả ảnh hưởng nồng độ muối NH4Cl.
Bảng 3.7. Kết quả ảnh hưởng nồng độ muối NH4Cl
Nồng độ (g/l) OD (600nm)
0,1 0,150 ± 0,015c
0,3 0,151 ± 0,011b 0,5 0,185 ± 0,003a
0,7 0,136 ± 0,006d
0,9 0,098 ± 0,002d
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0,16
0,18OD 600 nm
Nhiệt Độ
Ảnh Hưởng của nhiệt độ
350C 400C 300C
45
Hình 3.16: Đồ thị kết quả ảnh hưởng nồng độ muối NH4Cl
Nhận Xét: Qua bảng và đồ thị cùng với xử lý thống kê chúng tôi nhận thấy nồng độ muối NH4Cl có ảnh hưởng nhất định tới sự sinh trưởng và phát triển của chủng TH7. Ở cả 3 lần lập lại trong môi trường MT1 với những nồng độ muối khác nhau ta thấy ở nồng độ 0,5 g/l kết quả đo OD 600 nm cao nhất (0,185) và có sai khác so với các nồng độ còn lại 0,1 g/l; 0,3 g/l; 0,7 g/l; 0,9 g/l kết quả đo OD 600 nm lần lượt là 0,150, 0,151, 0,136, 0,098 thấp hơn so với nồng độ 0,5 g/l. Qua đó ta thấy nồng độ muối NH4Cl =0,5 g/l là nồng độ muối tối ưu cho sự phát triển và sinh trưởng của chủng TH7.
Kết Luận: Nồng độ muối thích hợp cho sự phát triển của chủng TH7 là 0,5 g/l 3.3.5 Kết quả khảo sát nguồn lưu huỳnh.
Bảng 3.8. Kết quả khảo sát nguồn cơ chất
Nguồn cơ chất Na2S2O3 Na2S S
cfu/ml x106 1,56 ± 0,16a 0,58 ± 0,24b 0,31 ± 0,03b
0 0,05 0,1 0,15 0,2
OD 600nm
g/l
Khảo sát ảnh hưởng nồng độ muối NH4Cl
TH7
0,1 0,3 0,5 0,7 0,9
46
Hình 3.17: Đồ thị kết quả khảo sát nguồn cơ chất.
Nhận xét: Dựa vào bảng và đồ thị cùng với xử lý thống kê sau khi khảo sát 3 nguồn cơ chất khác nhau ta nhận thấy. Mật độ khuẩn lạc sau khi cấy trang ở nguồn lưu huỳnh từ Na2S2O3 đạt cao nhất 1,56x106 cfu/ml và sai khác có ý nghĩa đối với 2 nguồn lưu huỳnh còn lại là Na2S và S. Ở nguồn lưu huỳnh Na2S mật độ khuẩn lạc sau khi cấy trang thấp hơn Na2S2O3 và sai khác không có ý nghĩa so với nguồn lưu huỳnh từ S. Chứng tỏ nguồn lưu huỳnh từ Na2S2O3 tốt nhất cho chủng TH7. Tiếp tục khảo sát hàm lượng Na2S2O3 tới sự tạo sinh khối của chủng TH7
Kết Luận: nguồn lưu huỳnh từ Na2S2O3 là thích hợp hơn cả cho chủng TH7.
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 cfu/ml x106
Nguồn cơ chất
Khảo sát ảnh hưởng nguồn cơ chất
TH7
Na2S2O3 Na2S S
47
3.3.6 Kết quả khảo Sát sự ảnh hưởng của nồng độ Na2S2O3
Bảng 3.9. Kết quả Khảo Sát sự ảnh hưởng của nồng độ Na2S2O3 Nồng độ
Na2S2O3 (g/l)
OD 600nm
4 0,047 ± 0,003d
5 0,151 ±0,005a
6 0,124 ± 0,004b
7 0,007 ±0,007c
8 0,059 ± 0,009d
Nhận xét: Qua bảng và đồ thị cùng với xử lý thống kê chúng tôi thấy nồng độ Na2S2O3 có ảnh hưởng tới sự phát triển của chủng TH7 đặc biệt ở nồng độ 5g/l kết quả do OD 600 nm là 0,151 cao hơn so với các nồng độ còn lại và sai khác có ý nghĩa đối với 4 nồng độ còn lại. Ở nồng độ 6 g/l và 7 g/l kết quả cho thấy mật độ vi khuẩn thấp hơn so với 5 g/l, tương tự ở nồng độ 4 g/l và 8g/l cho thấy mật độ vi khuẩn thấp hơn so với 5 g/l và sai khác giữa hai nồng độ này không có ý nghĩa đồng thời mật độ vi khuẩn cũng thấp hơn so
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0,16
0,18OD 600 nm
g/l Ảnh hưởng nồng độ Na2S2O3 tới sự phát triển của
chủng TH7
4 5 6 7 8
48
với các nồng độ còn lại. Có thể khi tăng nồng độ cơ chất vi khuẩn sử dụng đã tạo ra chất ức chế, ức chế ngược lại làm giảm sự sinh trưởng và phát triển của chủng. Từ những nhận định trên có thể thấy nồng độ Na2S2O3 là 5 g/l là thích hợp cho sinh trưởng và phát triển của chủng TH7.
Kết luận: Nồng độ Na2S2O3 là 5 g/l là thích hợp cho sinh trưởng và phát triển của chủng TH7.
2.4.2. Kết quả khảo sát động học quá trình lên men
Hình 3.18: Khuẩn lạc ở thời gian 48 giờ Bảng 3.10. Kết quả khảo sát động học quá trình lên men
Thời gian Cfu/ml.106
8 0,080
16 0,087
24 1,883
32 7
40 10,8
48 15,8
56 14,667
64 13,533
49
Hình 3.19: Đồ thị khảo sát động học quá trình lên men chủng TH7
Nhận xét: Để loại trừ số lượng vi khuẩn chết trong quá trình nuôi cấy và có số liệu chính xác cho quá trình phối trộn chế phẩm vi sinh (cfu/ml dịch nuôi cấy) của chủng TH7, ta tiến hành đếm khuẩn lạc trong quá trình nuôi cấy thay cho đo mật độ quang. Qua bảng và đồ thị kết hợp với xử lý thống kê, ta nhận thấy sau 48 giờ nuôi cấy trong muôi trường lỏng số lượng tế bào đạt cao nhất 15,8x106 cfu/ml. Ở 40 giờ số lượng tế bào là 10,8x106 cfu/ml thấp hơn so với 48 giời. Tương tự ở 56 giờ số lượng tế bào cũng thấp hơn so với 48 giờ 14,667x106 < 15,8x106. Chứng tỏ thời gian lên men tối ưu cho môi trường là 48 giờ.
Kết Luận: Thời gian lên men tối ưu cho chúng TH7 trong môi trường lỏng MT1 là 48 giờ.
-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
0 20 40 60 80
cfu/ml.106
Thời gian
Động học quá trình lên men chủng TH7
50
3.3. Kết Quả tiến hành lên men thử nghiệm tạo chế phẩm ở quy mô phòng thí nghiệm.
Bảng 3.11. Kết quả kiểm tra nồng độ tế bào trước và sau khi sấy.
Số lượng tế bào (cfu/ml )
Chủng TH7
Sau lên men 36x106
Sau khi sấy 7,7x 106
Hình 3.20: Môi trường lỏng sau lên men TH7
TH7 TH7
TH7
51
Hình 3.21: Chế phẩm sau khi sấy chủng TH7
Từ các yếu tố tối ưu đã khảo sát được như trên, tiến hành sản xuất ở quy mô phòng thí nghiệm
Chủng TH7
Môi trường tối ưu MT1
Thời gian lên men tối ưu 48 giờ .
Kết quả thu được :
Thu được 2 lít môi trường lên men dạng lỏng phối trộn vào môi trường có thành phần bột cám gạo 90% và vỏ trấu ghiền 10% sau đó đem sấy ở 40oC cho đến khô thu được chế phẩm dạng thô.