Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.2. Khảo sát môi trường, pH, nhiệt độ, nồng độ muối, nguồn cơ chất, thời
2.3.2.1. Khảo sát môi trường tối ưu.
Bố trí thí nghiệm
Các chủng vi khuẩn sau khi được phân lập và tuyển chọn được khảo sát ở 5 môi trường khác nhau. MT1; MT2; MT3; MT4; MT5 (lặp lại 3 lần) . Sau 72 giờ nuôi lắc ở 180 vòng/phút. Sinh trưởng được theo dõi bằng phương pháp đo mật độ tế bào với bước sóng 600 nm trên máy đo so màu
+Phương pháp đo độ đục (OD)
Sinh trưởng được theo dõi bằng phương pháp đo mật độ tế bào với bước sóng 600 nm trên máy đo so màu. Kết quả OD cho ta biết độ đục của canh
trường nuôi cấy vi sinh. Dùng phương pháp này cho phép ta so sánh được lượng sinh khối giữa các dịch canh trường. Đây là phương pháp đơn giản, cho kết quả nhanh nhưng kết quả chỉ mang tính so sánh giữa các mẫu có môi trường tương tự nhau.
2.3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH
29
PH là yếu tố môi trường có tính chất quan trọng giống như nhiệt độ. pH quá thấp hay quá cao cũng đều ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn.
Bố Trí thí nghiệm
Tiến hành nghiên cứu dải pH: 4; 5; 6; 7; 8 và 9 trong các ống nghiệm môi trường MT1 (lặp lại 3 lần) đã được hấp khử trùng ở 121oC, 1 atm trong 15 phút.
Sau 72 h nuôi cấy, xác định khả năng sinh trưởng bằng phương pháp đo độ, phương pháp đo độ đục được tiến hành như thí nghiệm trên.
2.3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ là yếu tố có tác động đến các quá trình sinh hóa trong quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Tuỳ từng loại vi khuẩn mà nhiệt độ có ảnh hưởng khác nhau. Để tìm ra nhiệt độ thích hợp cho quá trình sinh trưởng và phát triển của các chủng:
Bố trí thi nghiệm.
Tiến hành nuôi lắc các chủng trong các ống nghiệm chứa môi trường MT1 ở các nhiệt độ 30, 35, 400C (lặp lại 3 lần) . Sau 72h lên men, xác định khả năng sinh trưởng bằng phương pháp đo độ đục, phương pháp đo độ đục được tiến hành như thí nghiệm trên.
2.3.2.4. Ảnh hưởng của nồng độ NH4Cl
Bố trí thí nghiệm
Để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NH4Cl đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng sulfat hoá tôi tiến hành thí nghiệm (lặp lại 3 lần) bổ xung NH4Cl vào các ống nghiệm chứa môi trường Beijeninck với hàm lượng từ 0,1, 0.3, 0.5, 0.7, 0.9, g/l đã được hấp khử trùng ở 121oC, 1 atm trong 15 phút. Do môi trường là giống nhau nên tôi chọn phương pháp so sánh mật độ bằng đo OD. Phương pháp được tiến hành như các thí nghiệm bên trên.
30
2.3.2.5. Ảnh hưởng của nguồn lưu huỳnh đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng nghiên cứu
Vi khuẩn sunlfate hoá là nhóm vi khuẩn có khả năng oxy hoá lưu huỳnh, hydrosunfua, Na2S2O3 và Na2S4O6 thành sulfat mà không để lưu huỳnh đọng lại trong tế bào. Vi khuẩn sulfate hoá hầu như không sử dụng được nguồn cacbon hữu cơ, chúng lấy năng lượng từ qúa trình oxy hoá lưu huỳnh và các hợp chất của lưu huỳnh như hydrosunfua, sulfid và thiosunfat...Vì vậy việc lựa chọn được nguồn lưu huỳnh thích hợp làm tăng hiệu quả quá trình lên men.
Bố Trí thí nghiệm
Với mục đích tìm ra được nguồn cung cấp lưu huỳnh thích hợp nhất chúng tôi tiến hành thí nghiệm với những lựa chọn dùng: lưu huỳnh, Na2S, Na2S2O3 với lượng bổ sung vào các ống nghiệm chứa môi trường Beijeninck là 5g/l, sau 72h nuôi cấy dịch lên men được trang cấy đếm khuẩn lạc.
Xác định số lượng tế bào bằng Phương pháp cấy gạt (hộp trải)[8]
Mẫu cần xác định số lượng được lắc đều dùng pipet vô trùng hút 1ml dịch chứa vi sinh vật cho vào ống chứa 9 ml dung dịch muối sinh lý (NaCl = 0.85%)vô trùng, trộn đều.
Pha loãng dịch huyền phù tế bào ở nồng độ thích hợp như : 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 ... tiến hành cấy mẫu ở các độ pha loãng khác nhau vào các đĩa Petri (lặp ba, tức là cấy mẫu ở mỗi độ pha loãng vào 3 đĩa Petri). Hút 0,1ml cho vào đĩa thạch đã chuẩn bị sẵn. Dùng que gạt vô trùng gạt đều trên bề mặt thạch.
Nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp và theo dõi trong vòng từ 24 - 72 h.
Đếm số lượng khuẩn lạc vi khuẩn trên từng đĩa và tính theo công thức:
Mi (CFU/ml) = Ai/Di/V Trong đó:
31 CFU- Conoly forming unit.
Ai là số khuẩn lạc trung bình/ đĩa Di là độ pha loãng
V là dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml)
Mật độ tế bào trung bình M trong mẫu ban đầu là trung bình cộng của Mi ở các nồng độ pha loãng khác nhau.
2.3.2.6. Nghiên cứu động học của quá trình lên men.
Các chủng vi khuẩn sulfate hoá được nuôi trong môi trường Beijeninck lỏng chứa 20mg/l S- S2O32-. Các bình nuôi lắc ở nhiệt độ và pH thích hợp với tốc độ 200 vòng/phút. Cứ sau 8 giờ lấy mẫu một lần, kiểm tra mật độ tế bào bằng phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc trên môi trường Beijeninck thạch đĩa, phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc được tiến hành như các thí nghiệm bên trên.