CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.7. Phương pháp xác định thành phần hóa học có trong cao chiết
Nguyên tắc: Định tính các nhóm chất hữu cơ trong thành phần cao chiết từ cây Sứ trắng bằng các phản ứng với thuốc thử đặc trưng dựa trên tính chất hóa học của chúng theo các phương pháp thông dụng trong phòng thí nghiệm đã được chuẩn hoá để sơ bộ hóa thành phần hoạt chất.
Cách tiến hành: Cao chiết được đem ngâm trong dung môi thích hợp, tiến hành lọc và thu dịch lọc. Sau đó dùng dịch cao chiết này tiến hành định tính các thành phần hóa học với các loại hóa chất, thuốc thử đặc trưng.
2.3.7.1. Định tính carbohydrate
Thử nghiệm Molisch: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó cho 5 - 6 giọt thuốc thử Molisch vào, tiếp tục nhỏ từ từ 2 ml dung dịch H2SO4đậm đặc vào
29
và đọc kết quả. Kết quả được xem là dương tính khi có hình thành phức hợp màu đỏ - tím.
Thử nghiệm Fehling: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, cho lần lượt 1 ml thuốc thử Fehling A và 1 ml Fehling B vào. Đun cách thủy 5 phút và đọc kết quả.
Kết quả dương tính khi có xuất hiện tủa màu đỏ của Cu2O.
Thử nghiệm Barfoed: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml thuốc thử Barfoed. Đun cách thủy hỗn hợp trong 5 phút, sau đó làm lạnh ngay và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi hình thành kết tủa màu đỏ gạch.
2.3.7.2. Định tính alkaloid
Thử nghiệm Mayer: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer và đọc kết quả. Kết quả dương tính là khi quan sát được kết tủa màu trắng đục tạo thành.
Thử nghiệm Dragendorff: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendorff và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi hình thành kết tủa màu vàng cam.
Thử nghiệm Hager: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml thuốc thử Hager và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi hình thành kết tủa màu vàng.
Thử nghiệm Wagner: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và bổ sung 2 ml thuốc thử Wagner vào và đọc kết quả. Kết quả dương tính là khi hình thành kết tủa màu nâu đỏ
2.3.7.3. Định tính saponin
Thử nghiệm tạo bọt: Hút 5 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó lắc mạnh và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi ống nghiệm có xuất hiện bọt và ổn định 2.3.7.4. Định tính cardiac glycoside
Thử nghiệm Legal: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 1 ml pyridine và 1 ml Na nitro prusside, sau đó bổ sung 5 - 6 giọt NaOH 10% vào và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi xuất hiện màu đỏ đậm.
30
Thử nghiệm Keller Killiani: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm 2 ml acid acetic glacial và 1 ml dung dịch FeCl3, cho từ từ 2 ml H2SO4 đậm đặc vào và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi xuất hiện màu xanh trong lớp acid acetic.
2.3.7.5. Định tính flavonoid
Thử nghiệm Alkaline: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm rồi cho vào vài giọt NaOH 10% thấy xuất hiện màu vàng, thêm vài giọt HCl loãng vào thấy ống nghiệm về màu cao ban đầu chứng tỏ có sự hiện diện của Flavonoid (mẫu đối chứng làm tương tự, thay NaOH 10% thành nước cất). Kết quả dương tính nếu xuất hiện màu vàng đậm khi bổ sung NaOH và trở về màu cao ban đầu khi bổ sung HCl. Có thực hiện ống đối chứng dương thay NaOH thành nước cất.
Thử nghiệm Ferric chloride: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó thêm vài giọt thuốc thử Ferric chloride 10% và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi ống nghiệm xuất hiện màu xanh hoặc tím.
2.3.7.6. Định tính các hợp chất phenol
Thử nghiệm lead acetate: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, rồi cho vào 1.5 ml lead acetate 10% sau đó đọc kết quả. Kết quả dương tính khi xuất hiện kết tủa trắng trong ống nghiệm.
Thử nghiệm Gelatin: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm vài giọt galatin 1% vào và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi xuất hiện kết tủa trắng.
2.3.7.7. Định tính tannin
Thử nghiệm ferric chloride: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml NaCl 10%, cho 4 giọt thuốc thử ferric chloride 10% và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi ống nghiệm xuất hiện tủa màu xanh, xanh – đen.
Thử nghiệm lead acetate: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm và thêm 2 ml NaCl 10%, cho 4 giọt thuốc thử chì acetate vàovà đọc kết quả. Kết quả dương tính khi ống nghiệm xuất hiện màu vàng.
31
2.3.7.8. Định tính steroid
Thử nghiệm Salkowski: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, thêm vào 2 ml chloroform và nhỏ từ từ 2 ml H2SO4đậm đặc, lắc mạnh rồi để yên cho tách thành 2 lớp và đọc kết quả ở mặt phân cách. Kết quả xác định được chia thành 2 trường hợp:
ở lớp dưới xuất hiện màu đỏ là sterol, xuất hiện màu vàng là triterpenoid.
Thử nghiệm Libermann Burchard: Hút 2 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm thêm 2 ml acid anhydride, đun sôi và làm nguội nhanh. Sau đó nhỏ từ từ H2SO4đậm đặc dọc theo thành ống nghiệm rồi đọc kết quả. Kết quả xác định được chia thành 2 trường hợp: nếu xuất hiện vòng màu đỏ ở mặt phân cách là steroid. Nếu hình thành màu nâu đỏ đậm là triterpenoid.
2.3.7.9. Định tính amino acid
Thử nghiệm Ninhydrin: Hút 1 ml dịch cao chiết cho vào ống nghiệm, sau đó cho vào một vài giọt thuốc thử Ninhydrin, đun sôi cách thủy trong 5 phút và đọc kết quả. Kết quả dương tính khi thấy xuất hiện màu tím.