1.4. Ứng dụng để nhuộm esteraza bạch cầu người
1.4.2. Giới thiệu về esteraza
Theo phân loại của tiểu ban enzym (EC) thuộc Hội Hóa sinh quốc tế (IUB), esteraza là một enzym hiđrolaza thuộc nhóm cacboxylesteraza (E.C.3.1.1.1) [24]
xúc tác các phản ứng thủy phân este cacboxylat thành axit và ancol, trong môi trường nước được gọi là sự thủy phân:
Este cacboxylat + H2O ancol + axit cacboxylic
Esteraza có mặt ở hầu hết các mô trong cơ thể. Hàm lƣợng cao nhất là trong các tế bào thực bào, sau đó đến tế bào gan, ruột, dạ dày, phổi, tiền liệt tuyến, tụy và ít nhất là trong tế bào não. Trong tế bào, esteraza thường phân bố chủ yếu trong lưới nội nguyên sinh chất, máy golgi, lysosom và màng tế bào [12,19,23]. Về cấu tạo esteraza là một enzym serin có tâm hoạt động đƣợc cấu tạo bởi axit amin Ser đóng vai trò nucleophin, His đóng vai trò bazơ và một axit amin thứ 3, đóng vai trò axit là Asp, ở một số isoenzym thì Asp đƣợc thay thế bằng Glu và vì thế esteraza không
12
đặc hiệu còn đƣợc gọi là enzym có tâm hoạt động theo cơ chế Ser-His-Asp/Glu [20]
hình 1.
Hình 1. Tâm hoạt động của esteraza không đặc hiệu.
Esteraza là nhóm enzym không đồng nhất về mặt cấu trúc [21]. Các công trình công bố gần đây cho thấy trong các tổ chức khác nhau thì esteraza không đặc hiệu có cấu trúc khác nhau. Trọng lƣợng phân tử từ 19.500-180.000 dalton (Da) [13]. Kích thước của enzym vào khoảng 2-3 Ǻ. Bằng kỹ thuật sắc ký cột sephadex Kaphalia và c.s đã xác định đƣợc esteraza gồm 2 chuỗi có trọng lƣợng phân tử là 60kDa và phần kia là 180 kDa. Phần 180 kDa là một trimer và bị ức chế bởi diisopropyl flophotphat trong các phản ứng nhuộm, tức nó thuộc loại B esteraza (bị ức chế bởi hợp chất florua - NSE) [10-12].
Về mặt điện tích thì esteraza là một enzym mang điện tích âm và các isoenzym nằm trong vùng đẳng điện (pI) từ 5,5-6,1 [17]. Nhiều isoenzym có tính đặc hiệu khá cao cho từng dòng tế bào và có thể coi nó nhƣ một giá trị tham chiếu để nhận dạng dòng tế bào. SM Gignac và c.s [5] bằng phương pháp điện di đã tìm ra 5 isoenzym khác nhau của esteraza trong các tế bào máu, là esteraza mono 1/mono 2 tìm thấy trong các tế bào bạch cầu mono (NSE); My 1/My 2 dòng tủy (esteraza đặc hiệu), bệnh đa u tủy, dòng hồng cầu, dòng tiểu cầu; Lym 1/Lym 2 trong tế bào lympho và cuối cùng là Unc trong tế bào chƣa biệt hóa. Nhƣ vậy có thể khẳng định esteraza là một tập hợp gồm nhiều isoenzym không đồng nhất. Bằng phương pháp sắc ký điện di Scott và c.s đã thu đƣợc esteraza tinh khiết từ các tế bào bạch cầu
13
dòng tủy và tìm ra hai isoenzym của esteraza không đặc hiệu A và B. Hai isoenzym này thường có mặt trong các bào quan của cả hai dòng bạch cầu đoạn và bạch cầu mono. Nhiều công trình nghiên cứu gần đây cũng cho thấy hai isozym này khác nhau về sự ức chế bởi nhiệt độ và NaF [2, 3, 16].
Trong tế bào bạch cầu người, esteraza được chia làm hai nhóm là esteraza đặc hiệu và không đặc hiệu. Esteraza đặc hiệu chủ yếu phân bổ trong các tế bào dòng tủy, xuất hiện từ tiền tủy bào đến bạch cầu đoạn trưởng thành. Nhuộm esteraza đặc hiệu chủ yếu dùng các este napthol AS thế 2-clo cacboxylat nhƣ: Naphtol AS-D cloaxetat, naphtol AS-D clopropanoat... Esteraza không đặc hiệu (NSE) đƣợc nhuộm bằng các este napthol AS thế cacboxylat không có nguyên tử clo ở vị trí nhƣ: Naphtol AS axetat, napthol AS-MX butanoat... Sở dĩ đƣợc gọi là esteraza không đặc hiệu vì nó có trong hầu hết các dòng tế bào. Khi nhuộm bằng các cơ chất trên với chất ức chế bằng NaF thì chỉ có NSE trong bạch cầu mono bị ức chế hoàn toàn, không hiện màu trong phản ứng nhuộm màu. Dựa vào tính chất khác nhau trong quá trình nhuộm NSE này để phân biệt thể bệnh bạch cầu cấp dòng monoxit với các dòng tế bào khác theo tiêu chuẩn FAB (Bảng 1.2).
14
Bảng 1.2. Bảng phân loại bệnh ung thƣ máu dòng mono theo FAB bổ sung Marker và di truyền [8]
Hình thái học và số lƣợng tế bào tủy Hóa học tế bào Marker CD Di truyền M4
1) <50% SLTBT là nguyên hồng cầu;
2) ≥30% tế bào có nhân trong tủy là blasts;
3) 30-80% SLTBT là tế bào dòng tủy đã bao gồm cả blasts;
4) 20-80% SLTBT là bạch cầu monoxít;
5) Có thể xuất hiện thể Auer trên nguyên sinh chất;
6) Số lƣợng bạch cầu monoxít trong máu >5.109 hoặc
<5.109 kèm tăng lysozym trong huyết tương.
Peroxidaza, Sudan B, esteraza đặc hiệu dòng tủy, esteraza không đặc hiệu có và không có chất ức chế NaF dương tính.
1) CD (+): 13, 14, 15, 33;
2) HLA-DR (+).
t(9; 11) (p22;
q23)
M4eo 1) <50% SLTBT là nguyên hồng cầu;
2) ≥30% tế bào có nhân trong tủy là blasts;
3) 30-80% SLTBT là tế bào dòng tủy đã bao gồm cả blasts;
4) 20-80% SLTBT là bạch cầu monoxít;
5) Có thể xuất hiện thể Auer trên nguyên sinh chất;
6) ≥5% tế bào không phải dòng hồng cầu là bạch cầu ƣa axít và gặp các tế bào ưa axít bất thường;
7) Số lƣợng bạch cầu monoxít trong máu >5.109 hoặc
<5.109 kèm tăng lysozym trong huyết tương.
Peroxidaza, Sudan B, esteraza đặc hiệu dòng tủy, esteraza không đặc hiệu có và không có chất ức chế NaF dương tính.
1) CD (+): 13, 14, 15, 33;
2) HLA-DR (+).
t(16; 16) inv(16)
15
Hình thái học và số lƣợng tế bào tủy Hóa học tế bào Marker CD Di truyền M5a
1) <50% SLTBT là nguyên hồng cầu;
2) ≥30% tế bào có nhân trong tủy là blasts;
3) ≥80% tế bào không phải dòng hồng cầu là monoxít;
4) ≥80% tế bào monoxít là monoblast;
5) Hiếm khi xuất hiện thể Auer trên nguyên sinh chất.
1) Peroxidaza, Sudan B âm tính hoặc dương tính yếu;
2) Esteraza đặc hiệu dòng tủy âm tính;
3) Esteraza không đặc hiệu dương tính mạnh và bị ức chế bởi NaF.
1) CD (+): 13, 14, 15, 33;
2) HLA-DR (+).
t(9; 11) (p22:q23)
M5b 1) <50% SLTBT là nguyên hồng cầu;
2) ≥30% tế bào có nhân trong tủy là blasts;
3) ≥80% tế bào không phải dòng hồng cầu trong tủy là monoxít;
4) <80% tế bào monoxít là monoblast;
5) Hiếm khi xuất hiện thể Auer trên nguyên sinh chất.
1) Peroxidaza, Sudan B âm tính hoặc dương tính yếu;
2) Esteraza đặc hiệu dòng tủy âm tính;
3) Esteraza không đặc hiệu dương tính mạnh và bị ức chế bởi NaF.
1) CD (+): 13, 14, 15, 33;
2) HLA-DR (+).
t(8; 16) (p11:p13)
16
Nhƣ vậy, trong các kỹ thuật nhuộm hóa học tế bào thì kỹ thuật nhuộm phát hiện NSE là một xét nghiệm quan trọng giúp phân biệt ung thƣ máu thể M4 và thể M5 với các thể khác. Đó là các thể ung thƣ hỗn hợp dòng tủy – monoxit (M4) và dòng monoxit (M5). Ở các thể này NSE dương tính rất mạnh nhưng ở thể M5 thì bị ức chế hoàn toàn bởi NaF [18] và đây là cơ sở để phân biệt bạch cầu cấp dòng monoxit với các dòng tế bào khác.