Đề tài đƣợc bắt đầu từ nghiên cứu tổng hợp các 3-[(N-phenyl thế)carbamoyl]naphtalen-2-yl cacboxylat bằng phương pháp truyền thống. Naphtol AS-thế cacboxylat được tổng hợp theo phương pháp 2 giai đoạn,
Giai đoạn 1: 3-hidroxyl-[(N-phenyl thế)carbamoyl]naphtalen 2-cacboxamit phản ứng với NaOH theo tỷ lệ 1:1 tạo thành muối naphtolat.
Giai đoạn 2: muối naphtolat thu đƣợc tác dụng với axetyl clorua thu 3-[(N- phenyl thế)carbamoyl]naphtalen-2-yl cacboxylat.
Phản ứng tổng hợp este giữa naphtol AS thế với dẫn suất alkanoyl clorua đi qua hai giai đoạn hai giai đoạn nhƣ sơ đồ 3.1 [7].
Sơ đồ 3.1 Giai đoạn 1:
NH O
OH
X Y
NH O
ONa X
Y
+ NaOH THF, 0
0C
Giai đoạn 2:
NH O
ONa X
Y
+ RCOCl
00C NH
O
O O R
X Y
Cơ chế của phản ứng có thể đƣợc miêu tả trong sơ đồ 3.2 nhƣ sau:
30 Sơ đồ 3.2
Phản ứng đƣợc thực hiện ở 00C, tuy nhiên theo cách này hiệu suất sản phẩm thu đƣợc không cao khoảng 40-50%. Điều này có thể đƣợc giải thích do trong dung môi phản ứng có nước trong giai đoạn tạo muối phenolat nên khi bổ sung thêm alkanoyl clorua ở bước 2, chất này dễ bị thủy phân (sơ đồ 3.3) do tác dụng với nước tạo thành axit đặc biệt trong môi trường kiềm:
Sơ đồ 3.3
R O Cl
+ H2O R
O OH
+ HCl
Mặt khác sản phẩm tạo thành kém bền nhiệt, vì vậy nhiệt độ phản ứng, thời gian xử lý sau phản ứng cũng là một trong những nguyên nhân gây nên hiệu suất thấp.
Nhƣ vậy có thể thấy hiệu suất phản ứng phụ thuộc chủ yếu vào ba yếu tố:
một là, tỷ lệ các tác nhân tham gia phản ứng; hai là, nhiệt độ; ba là bản chất dung môi. Để nâng cao hiệu suất sản phẩm, đã tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng lên phản ứng. Đối tƣợng khảo sát đƣợc chọn là N-(2-methoxylphenyl)-3- hiđroxinaphtalen-2-cacboxamit (Naphtol AS-OL) : butanoyl clorua; mỗi điều kiện khảo sát đƣợc thí nghiệm lặp lại 3 lần và lấy hiệu suất trung bình sau tinh chế.
31 a) Ảnh hưởng của bản chất dung môi
Dung môi đƣợc sử dụng trong các phản ứng đóng một vai trò rất quan trọng đối với sản lượng của sản phẩm thu được. Dung môi được lựa chọn trước hết phải khan để tránh thủy phân RCOCl, sau đó phải hòa tan tốt NaOH và naphtol để phản ứng đồng thể và quá trình tạo naphtolat đạt kết quả tốt. Mặt khác đây là phản ứng SN2 nên các dung phân cực aprotic nhƣ DMF, DMSO, axeton đƣợc ƣu tiên hơn.
Trong công trình này đã tiến hành khảo sát các dung môi axeton, DMSO, acetonitrin, DMF. Tiến trình phản ứng theo dõi trên TLC cho thấy phản ứng chạy tốt. Tuy nhiên sau khi xử lý hiệu suất chỉ đạt 30-54%, có lẽ sản phẩm 3-(N- phenyl)nahthalen-2-yl cacboxylat tạo thành tan tốt trong những dung môi này khiến việc kết tinh để thu sản phẩm gặp khó khăn. Tiến hành thí nghiệm thêm với dung môi EGME, hiệu suất thu đƣợc khả quan hơn hẳn (66,8%). Điều này có thể đƣợc giải thích do EGME có khả năng hòa tan tốt NaOH, tăng hiệu suất giai đoạn tạo naphtolat, mặt khác, sản phẩm tạo thành có độ phân cực kém hơn nhiều đã hạn chế khả năng hòa tan trong dung môi này đã tạo thuận lợi cho việc hình thành kết tủa và thu sản phẩm.
Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của bản chất dung môi đến hiệu suất của phản ứng
THF Axeton DMSO EGME Acetonitrin DMF
Hiệu suất % 52 30.2 40.5 66.8 48.6 32.1
0 10 20 30 40 50 60 70 80
Hiệu suất %
32
b) Ảnh hưởng của tỷ lệ tác nhân tham gia phản ứng
Căn cứ tài liệu tham khảo [7], đã thực hiện phản ứng ở nhiệt độ 00C, trong dung môi EGME, với tỷ lệ Naphtol AS-OL: butanoyl clorua thay đổi lần lƣợt là 1 : 1,1; 1:1,2; 1:1,3; 1:1,5 và 1: 2. Kết quả khảo sát cho thấy, khi thay đổi tỷ lệ butanoyl clorua tăng từ 1,1 lên 1,3 so với chất đầu, hiệu suất phản ứng tăng lên từ 66,8 lên 68,8% . Tuy nhiên khi tăng tác nhân butanoyl clorua lên nữa hiệu suất cũng gần nhƣ không thay đổi (69,3%). Trong khi những tác nhân này đƣợc bán khá đắt trên thị trường nên tỷ lệ Naphtol AS-OL: butanoyl clorua =1:1,3 được lựa chọn (Hình 3.2).
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ tác nhân tham gia phản ứng đến hiệu suất của phản ứng
c) Ảnh hưởng của nhiệt độ
Khi tiến hành giữ nguyên các yếu tố tỷ lệ chất tham gia phản ứng N-(2- methoxylphenyl)-3-hiđroxinaphtalen-2-cacboxamit : butanoyl clorua = 1:1,3, sử dụng dung môi EGME và thời gian phản ứng 1h, nhiệt độ môi trường tham gia phản ứng thay đổi lần lƣợt là 0oC, -5oC và -10oC. Để nhiệt độ ổn định trong suốt quá trình phản ứng, đề tài đã sử dụng thiết bị tủ ẩm lạnh MIR-154 và đặt nhiệt độ khảo sát ổn định trong thời gian phản ứng.
66.8 67.2 68.8 69 69.3
60 65 70 75
1:1,1 1:1,2 1:1,3 1:1,5 1:2
Tỷ lệ chất tham gia phản ứng
Hiệu suất
33
Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất của phản ứng Kết quả khảo sát cho thấy, hiệu suất 3-[(2-methoxylphenyl)cacbamoyl]- naphthalen-2-yl butanoat (Naphtol AS-OL butanoat – 3b3) đạt 68,8%. Tiếp tục thực hiện phản ứng với nhiệt độ thấp hơn và cao hơn hiệu suất Naphtol AS-OL có xu hướng giảm xuống. Điều này có thể giải thích do este tạo thành có độ bền không cao ở nhiệt độ >-20oC [7], khi thực hiện ở nhiệt độ phản ứng tăng lên, một phần sản phẩm vừa hình thành bị phân hủy trở lại chất naphtol ban đầu đã làm giảm hiệu suất của phản ứng. Trong khi giảm nhiệt độ phản ứng để hạn chế phân hủy chất, dẫn đến tốc độ phản ứng cũng giảm khiến cho hiệu suất của phản ứng giảm theo.
Do đó nhiệt độ 0oC đƣợc lựa chọn làm yếu tố cố định thứ 3 của phản ứng.
d) Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian phản ứng
Trong công trình này, đã tiến hành khảo sát phản ứng ở các thời gian khác nhau từ 1,0h-3h. Kết quả khảo sát (bảng 2.4 và hình 3.4) cho thấy thời gian 2h, phản ứng đạt hiệu suất cao nhất. Khi kéo dài thời gian lên 3h, hiệu suất không tăng leen đáng kể. Có thể do cấu trúc sản phẩm có chứa nhóm chức amit và nhóm este là những nhóm khá nhạy cảm, dễ bị thủy phân. Nên khi kéo dài thời gian phản ứng trong môi trường kiềm đã làm ảnh hưởng đến độ bền của sản phẩm.
58 60 62 64 66 68 70 72 74
-15 -10 -5 0 5 10 15
Nhiệt độ
Hiệu suất
Hiệu suất
34
Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn sự ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hiệu suất của sản phẩm
Qua khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng, đã tìm được các điều kiện thích hợp nhất cho phản ứng tổng hợp naphtol AS-thế cacboxylat bằng phương pháp hai giai đoạn là:
- Dung môi: ethylene glycol monomethyl ether;
- Tỷ lệ mol Naphtol : Alkanoyl clorua = 1 : 1,3;
- Nhiệt độ: 00C;
- Thời gian phản ứng: 2h
Trong những điều kiện phản ứng trên, hiệu suất 3-[(2-methoxylphenyl) cacbamoyl]naphthalen-2-yl butanoat (Naphtol AS-OL butanoat – 3b3) đạt 80%.
Bằng các điều kiện thích hợp tìm đƣợc đã tổng hợp đƣợc 10 alkyl cacboxylat của Naphtol AS, AS-OL và AS-CA, trong đó có hai chất mới (3a2, 3c1). Kết quả tổng hợp, một số hằng số hóa lý và các dữ kiện phổ đƣợc đƣa ra trong bảng 3.1; 3.2; 3.3.
68.8
72
80 80.2 80.3
60 65 70 75 80 85
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
Hiệu suất %
Thời gian (giờ)
35
Bảng 3.1. Bảng kết quả tổng hợp các alkyl cacboxylat của Naphtol AS, AS-OL và AS-CA
STT Ký hiệu R X Y Hiệu suất Tnc (0C) Rf
1 3a1 CH3 H H 62 161-163 0,60
2 3a2
(chất mới) C2H5 H H 69 154-156 0,62
3 3a3 C3H7 H H 72 146-147 0,61
4 3a4 C4H9 H H 67 135-136 0,65
5 3b1 CH3 H OCH3 70 130-131 0,63
6 3b2 C2H5 H OCH3 71 107-109 0, 65
7 3b3 C3H7 H OCH3 80 95-96 0,69
8 3b4 C4H9 H OCH3 73 89-91 0,71
9 3c1
(chất mới) CH3 OCH3 Cl 65 168-170 0,60
10 3c3 C3H7 OCH3 Cl 68 141-143 0,63
Bảng 3.1 là kết quả tổng hợp và một số hằng số hóa lý của các Naphtol AS- thế cacboxylat. Hiệu suất phản ứng đạt mức khá từ 62-80%. Nhiệt độ nóng chảy của các chất thu được thấp hơn nhiều so với các chất đầu tương ứng. Điều đó được giải thích là bởi sau khi chuyển hóa thành este, khả năng tạo liên kết hidro giữa các phân tử bởi nhóm hydroxit đã không còn. Mặt khác, có thể thấy các cơ chất có mạch cacbon trong gốc cacboxyl dài hơn có nhiệt độ nóng chảy thấp hơn so với các dẫn xuất có mạch hiđrocacbon gốc cacboxyl ngắn. Kết quả này càng khẳng định án ngữ
8
5 7
6
1 2
4 3
NH
1' 6'
2' 5'
3' 4'
O
OCOR
Y
X
III(a-c)
36
không gian của gốc cacboxyl đều ảnh hưởng tới độ bền của phân tử, là nguyên nhân thúc đẩy sự phân hủy gốc cacboxyl.
Sản phẩm tổng hợp theo phương pháp truyền thống và phương pháp đã cải tiến cho kết quả tương đồng về Tnc, Rf và các dữ kiện phổ. Trên hình 3.5 là hình ảnh chụp sắc ký bản mỏng sau khi tiến hành phản ứng theo hai phương pháp. Có thể thấy rằng trên bản sắc ký bản mỏng của hỗn hợp sau phản ứng theo điều kiện đã cải tiến, lượng chất đầu vẫn còn nhưng đã giảm đáng kể so với phương pháp truyền thống.
Trong đó: 1: Naphtol AS-OL; 2: Naphtol AS-OL butanoat
Hình 3.5. Ảnh chụp sắc ký bản mỏng của Naphtol AS-OL butanoat tổng hợp theo phương pháp truyền thống (ảnh trái) và phương pháp cải tiến (ảnh phải)
Như vậy khi khảo sát một cách có hệ thống các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng đã tìm đƣợc điều kiện thích hợp tổng hợp các hợp Naphtol AS-thế cacboxylat cho hiệu suất cao hơn khoảng 20% so với phương pháp truyền thống. Điều này có ý nghĩa rất lớn với bệnh nhân và xã hội vì phát hiện bệnh sớm và giảm đƣợc chi phí điều trị khi mà giá thành của các chất này trên thị trường đang rất đắt đỏ.
Cấu trúc của các naphtol AS-thế cacboxylat đều đƣợc chứng minh bằng các phương pháp hóa lý hiện đại như IR, NMR, MS. Kết quả phân tích các dữ kiện phổ được trình bày trên các bảng 3.2; 3.3 dưới đây:
37
Bảng 3.2. Kết quả số liệu phổ IR và ESI-MS của các naphtol AS-thế cacboxylat.
Kí
hiệu R X Y KLPT IR (υ, cm- 1,KBr) m/z [Itd](%)
3a2 CH3 H H 319 3269 (NH), 3059 (Ar-H), 2980, 2937 (CH-sp3), 1761 (C=O este), 1651 (C=O
amit), 1595,1519, 1435 (C=C, Ar), 1205 (C-O-C), 1120 (C-N) 320,13 [M+H]+ 3a3 C2H5 H H 333 3269 (NH), 3059 (Ar-H), 2966, 2933 (CH), 1751 (C=O este), 1651 (C=O
amit), 1595,1517, 1436 (C=C, Ar), 1205 (C-O-C), 1126 (C-N) 334,22 [M+H]+ 3a4 C3H7 H H 347 3263 (NH), 3136 (Ar-H), 2951, 2874 (CH), 1755 (C=O este), 1648 (C=O
amit), 1590,1546, 1436 (C=C, Ar), 1250 (C-O-C), 1135 (C-N) 348,00 [M+H]+ 3b2 C4H9 OCH3 H 349 3378 (NH), 3059 (Ar-H), 2940, 2848 (CH), 1751 (C=O este), 1670 (C=O amit),
1595, 1519, 1461, 1436 (C=C, Ar), 1225 (C-O-C), 1116 (C-N), 372,05 [M+Na]+ 3b3 CH3 OCH3 H 363 3230 (NH), 3053 (Ar-H), 2962, 2929 (CH), 1759 (C=O este), 1641 (C=O amit),
1527,1490, 1458 (C=C, Ar), 1209 (C-O-C), 1132 (C-N) 364,52 [M+H]+ 3b4 C2H5 OCH3 H 377 3388 (NH), 3053 (Ar-H), 2959, 2940 (CH), 1777 (C=O este), 1659 (C=O amit),
1538, 1490, 1462, (C=C, Ar), 1258 (C-O-C), 1126 (C-N) 378,13 [M+H]+ 3c1 C3H7 OCH3 Cl 369 3383 (NH); 3277,3136 (Ar-H); 2841 (CH); 1772 (C=O este); 1664 (C=O amit);
1595, 1527 (C=C, Ar); 1222 (C- O-C); 1193 (C-N)
370,1 [M(35Cl)+H]+ 372,1[M(37Cl)+H]+ 3c2 C4H9 OCH3 Cl 397 3375 (NH); 3140 (Ar-H); 2972, 2939 (CH); 1766 (C=O este); 1562(C=O amit);
1593, 1523 (C=C, Ar); 1249 (C- O-C); 1085 (C-N)
398,1 [M(35Cl)+H]+ 400,11[M(37Cl)+H]+
8
5 7
6 1
2
4 3
NH
1' 6'
2' 5'
3' 4'
O
OCOR Y
X
III(a-c)
38
Bảng 3.3. Kết quả dữ liệu phổ 1H-NMR của 3-(N-thế-cacbamoyl) naphtalen-2-yl cacboxylat R: 9CH3
9CH2 10CH3
9CH210CH2 11CH3
9CH210CH211CH212CH3
Kí hiệu R X Y δ (ppm, J, Hz, DMSO)
3a2 CH2 CH3 H H
1,1 (t, 3H, H-10,3J=7,5); 2,6 (sextet, 2H, H-9, 3J=7,5); 7,1 (t, 1H, H-4’,
3J=7,3); 7,4 (t, 2H, H-3’, H-5’, 3J=7,5); 7,6-7,7 (m, 2H, H-6, H-7); 7,8(s, 1H, H-4); 7,9 (d, 2H, H-2’, H-6’, 3J=8,0); 8,0(d, 1H, H-5, 3J=8,0); 8,1 (d, 1H, H-8, 3J= 8,0); 8,3 (s, 1H, H-1); 10,5 (s, 1H, NH)
3a3 CH2CH2CH3 H H
1,0 (t, 3H, H-11,3J=7,5); 1,7 (sextet, 2H, H-10, 3J=7,5); 2,6 (t, 2H, H-9,
3J=7,5); 7,1 (t, 1H, H-4’, 3J=7,3, 4J=1,0); 7,3-7,4 (m, 2H, H-3’, H-5’,
4J=2,0); 7,5-7,6 (m, 2H, H-6, H-7, 4J=1,5); 7,7(s, 1H, H-4); 7,8 (d, 2H, H- 2’, H-6’, 3J=8,0); 7,9 (d, 1H, H-5, 3J=8,0); 8,0 (d, 1H, H-8, 3J= 8,0); 8,3 (s, 1H, H-1); 9,6 (s, 1H, NH)
3a4 CH2 CH2CH2CH3 H H
0,8 (t, 3H, H-12,3J=7,3); 1,3 (sextet, 2H, H-11, 3J=7,5); 1,5 (quintet, 2H, H-10, 3J=7,5); 2,5 (t, 2H, H-9, 3J=7,3); 7,1 (t, 1H, H-4’, 3J=7,3); 7,3 (t, 2H, H-3’, H-5’, 3J=7,7); 7,5-7,6 (m, 2H, H-6, H-7); 7,7 (d, 2H, H-2’, H-6’,
3J=7,5); 7,8 (s, 1H, H-4); 7,9 ( d, 1H, H-5, 3J=8,0); 8,1 (d, 1H, H-8, 3J=
8,0); 8,3 (s, 1H, H-1); 10,5(s, 1H, NH)
8
5 7
6 1
2
4 3
NH
1' 6'
2' 5'
3' 4'
O
OCOR Y
X
III(a-c)
39
3b2 CH2 CH3 OCH3 (11) H
1,1 (t, 3H, H-10); 2,6 (q, 2H, H-9); 3,8 (s, 3H, H-11); 7,0 (t, 1H, H-5’,
3J=7,5); 7,8 (s, 1H, H-1); 7,9 (d, 1H, H-8, 3J=8,0); 8,0 (s, 1H, H-6’); 8,4 (s, 1H, H-4); 9,5 (s, 1H, NH)
3b3 CH2CH2CH3 OCH3 (12) H
0,9 (t, 3H, H-11, 3J=7,3); 1,6 (Sextet, 2H, H-10, 3J= 7,0); 2,5(t, 2H, H-9) 3,8 (s, 3H, H-12); 6,9 (s, 1H, H-5’); 7,7 (s, 1H, H-4); 7,9 (d, 1H, H-5,
3J=7,0); 8,0 (s, 1H, H-6’); 8,1 (d, 1H, H-8, 3J=7,8); 8,4 (s, 1H, H-1); 9,5 (s, 1H, NH).
3b4 CH2 CH2CH2CH3 OCH3 (13) H
0,8 (t, 3H, H-12,3J=7,7); 1,3 (septet, 2H, H-11, 3J=7,5); 1,6 (sextet, 2H, H- 10, 3J=7,5); 2,3 (s, 3H, H-14); 2,6 (t, 2H, H-9, 3J=7,3); 7,2 (t, 1H, H-4’,
3J=7,5); 7,3 (t, 2H, H-3’, H-5’, 3J=7,7); 7,5-7,6 (m, 2H, H-6, H-7); 7,7 (d, 2H, H-2’, H-6’, 3J=7,5); 7,8 (s, 1H, H-4); 7,9 (d, 1H, H-5, 3J=8,0); 8,0 (d, 1H, H-8, 3J= 8,0); 8,3 (s, 1H, H-1); 10 (s, 1H, NH)
3c1 CH3 OCH3(10) Cl
2,3 (s, 3H, H-9); 3,9 (s, 3H, H-10); 7,4 (m, 2H, H-3’, H-4’); 7,6 (m, 2H, H- 6, H-7); 7,8 (s, 1H, H-6’); 8,1 (d, 1H, H-8, 3J=8,0); 8,2 (d, 1H, H-8,
3J=8,0); 8,4 (s, 1H, H-4); 8,7 (s, 1H, H-4); 9,6 (s, 1H, NH)
3c3 CH2CH2CH3 OCH3(12) Cl
0,9 (t, 3H, H-11, 3J=7,3); 1,7 (sextet, 2H, H-10, 3J=7,5); 2,7 (t, 2H, H-9,
3J=7,3); 4,0 (s, 3H, H-12); 7,1 (m, 2H, H-3’, H-4’); 7,6 (m, 2H, H-6, H-7,
4J=1,0); 7,7 (s, 1H, H-6’); 7,9 (d, 1H, H-5, 3J=8,0); 8,1 (d, 1H, H-8,
3J=8,0); 8,4 (s, 1H, H-4); 8,5 (s, 1H, H-1); 9,3 (s, 1H, NH)
40
Phổ IR của naphtol AS-thế cacboxylat đã không còn cực đại hấp thụ đặc trƣng cho dao động hóa trị của liên kết OH ở vùng 3256-3232 cm-1. Thay vào đó là dao động hóa trị của nhóm C=O este ở vùng 1751-1780 cm-1 với cường độ mạnh, chứng tỏ phản ứng đã xảy ra và este đã tạo thành. Ngoài ra trên phổ IR còn có dao động hóa trị của nhóm NH và C=O amit, xuất hiện tương ứng ở vùng 3232-3403 và 1648-1692 cm-1; hình dạng pic sắc nhọn, cường độ cao (Hình 3.6).
Hình 3.6. Phổ IR của Naphtol AS-OL butanoat
Phổ 1H-NMR: Ở vùng trường yếu xuất hiện cộng hưởng của proton nhóm NH ở ~10,5 ppm, đồng thời không thấy có pic cộng hưởng proton của nhóm hiđroxyl OH ở khoảng 11,02-12,10 ppm (hình 3.6). Tín hiệu cộng hưởng của các proton vòng thơm và vòng naphtyl ở vùng 7,0-8,50 ppm xuất hiện ở vùng trung bình. Các proton của nhóm thế nhân phenyl và gốc cacboxyl ở khoảng 0,84 ~ 4 ppm xuất hiện ở vùng trường mạnh. Độ chuyển dịch hóa học của các proton vòng naphtyl ít thay đổi, trong khi đại lƣợng này của các proton vòng phenyl phụ thuộc vào bản chất các nhóm thế X,Y. Nhóm thế đẩy điện tử (-OCH3) sẽ làm tăng mật độ điện tử trong vòng phenyl đặc biệt tại vị trí –octo làm cho độ chuyển dịch hóa học của các proton sẽ chuyển về phía trường mạnh và ngược lại. Các proton ở xa nhóm
41
thế trong nhân naphtyl ít bị ảnh hưởng hơn, nên độ chuyển dịch hóa học ít thay đổi hơn so với các proton gần trong nhân phenyl. Đối với proton của nhóm -NH cũng bị ảnh hưởng bởi các nhóm thế X, Y trên vòng phenyl thể hiện trên hình 3.7.
Hình 3.7. Phổ 1H-NMR của Naphtol AS-OL butanoat
Các nhóm thế đẩy điện tử làm cho pic cộng hưởng của proton nhóm -NH chuyển dịch về phía trường mạnh hơn, ngược lại nhóm thế hút điện tử làm cho độ chuyển dịch hóa học của proton chuyển dịch về phía trường yếu.
Các cơ chất của nhóm các chất này đều phải bảo quản ở nhiệt độ <-200C do dễ bị phân hủy [24], do đó đã tiến hành ghi phổ ESI-MS.
Phổ MS, các phân tử este naphtol AS thế cacboxylat không bền, rất dễ bị phân hủy dưới tác dụng chùm tia điện tử. Có thể thấy rõ trên phổ đồ, đa số các pic ion phân tử đều nhỏ hơn 50%. Bởi lẽ đây là những hợp chất có khối lƣợng phân tử lớn, trong phân tử lại chứa nhiều mối liên kết yếu nhƣ liên kết COOR, NH-CO amit.
Phổ MS của 3-[(2-phenyl thế)cacbamoyl] naphtalen-2-yl cacboxylat cho thấy liên kết este bị phá vỡ trước tiên tạo thành hai mảnh naphtyl anilit thế và mảnh cacbonyl axit. Sau đó mảnh gốc naphtyl tiếp tục bị cắt đứt liên kết amit (CO-NH) phân huỷ tạo thành hai mảnh ion chứa NH và CO tương ứng. Mảnh chứa vòng naphtalen tiếp tục
42
bị phân mảnh hình thành các mảnh nhỏ hơn. Trên hình 3.8 là phổ MS của naphtol AS- OL butanoat và sự phân mảnh chính đƣợc thể hiện trên sơ đồ 3.3.
Hình 3.8. Phổ ESI-MS của Naphtol AS-OL butanoat
Sơ đồ 3.4. Sơ đồ phân mảnh của hợp chất Naphtol AS-OL butanoat (3b3)
O
C O H3 O
O CH3
NH O
O O CH3
O C+
C3H7 O+ C3H7
C+ O
O
O+
O
O CH+
N H –
O C H3
43
3.2. Nghiên cứu tối ƣu hóa phản ứng nhuộm esteraza
Để đảm bảo kết quả nghiên cứu đạt tốt nhất, tiến hành nghiên cứu tối ƣu hóa điều kiện nhuộm esteraza đặc hiệu dòng mono theo phương pháp mô hình hóa thực nghiệm sử dụng cơ chất Naphtol AS propanoat. Tiến hành kỹ thuật nhuộm theo bảng các nhân tố thực nghiệm, kết quả thu được thể hiện trên bảng 3.4 dưới đây:
Bảng 3.4. Kết quả nhuộm theo phương pháp nhân tố thực nghiệm
TT A B C D E Hiệu suất thực nghiệm (%)
1. 6 0,6 1,0 25 30 48,5
2. 6 0,6 1,0 37 90 60,8
3. 6 0,6 0,6 25 30 50,6
4. 6 0,6 0,6 37 30 54,0
5. 6 0,6 1,0 37 30 58,4
6. 8 1,0 1,0 25 30 67,9
7. 6 0,6 0,6 25 90 61,4
8. 8 0,6 1,0 25 90 73,9
9. 8 0,6 1,0 25 30 67,7
10. 6 1,0 0,6 37 30 47,3
11. 8 1,0 1,0 37 30 68,4
12. 6 1,0 0,6 25 90 56,3
13. 6 0,6 0,6 37 90 51,9
14. 8 1,0 0,6 25 30 67,9
15. 8 0,6 0,6 37 90 68,8
16. 6 1,0 0,6 25 30 47,0
17. 8 0,6 0,6 25 30 65,9
18. 8 1,0 1,0 25 90 72,4
19. 8 1,0 1,0 37 90 72,3
20. 6 1,0 1,0 25 30 50,0
21. 8 1,0 0,6 37 90 68.8
22. 8 0,6 0,6 37 30 62,1
23. 8 0,6 0,6 25 90 64,7
24. 8 0,6 1,0 37 90 73,5
25. 8 1,0 0,6 37 30 61,7
26. 6 1,0 1,0 37 90 54,9
44 Từ số liệu thu được ta có phương trình hồi quy:
Hiệu suất (Yeild%) = 61.29 + 7.025 A - 0.7688 B + 2.112 C + 2.312 D - 0.1375 E + 1.025 A*B + 0.06875 A*C - 0.1813 A*D - 0.2438 A*E - 0.02500 B*C - 0.3625 B*D - 0.2500 B*E + 0.1938 C*D + 1.056 C*E - 0.9312 D*E - 0.4813 A*B*C + 0.3312 A*B*D - 0.1438 A*B*E + 0.2000 A*C*D - 0.6500 A*C*E + 1.712 A*D*E - 0.7062 B*C*D + 0.2188 B*C*E + 0.1687 B*D*E - 0.5250 C*D*E + 0.3125 A*B*C*D + 0.2500 A*B*C*E - 0.3000 A*B*D*E - 0.4063 A*C*D*E - 0.05000 B*C*D*E + 0.1813 A*B*C*D*E
Hình 3.9. Đồ thị Pareto các nhân tố ảnh hưởng đến hiệu suất nhuộm esteraza dòng mono
Đối với các thông số: A, C, D, A*D*E, C*E, A*B và D*E, giá trị ttính > tbảng; các thông số còn lại có ttính < tbảng cho thấy rằng không có ý nghĩa và do đó có thể bị loại bỏ ra khỏi mô hình. Công thức rút gọn của mô hình:
27. 8 0,6 1,0 37 30 67,9
28. 6 1,0 0,6 37 90 49,3
29. 8 1,0 0,6 25 90 69,2
30. 6 0,6 1,0 25 90 62,9
31. 6 1,0 1,0 37 30 58,4
32. 6 1,0 1,0 25 90 56,6
45
Hiệu suất nhuộm (H%1) = 61.29 + 7.025 A + 2.112 C + 2.312 D + 1.712 A*D*E + 1.056 C*E + 1.025 A*B - 0.9312 D*E
Kết quả của phương pháp quy hoạch thực nghiệm theo nhân tố cho thấy rằng hàm lƣợng dung môi DMF và thời gian nhuộm là 2 thông số không có nghĩa về mặt thống kê.
Mô hình dự đoán là phù hợp với dữ liệu quan sát (R2=0.986).
% hiệu suất nhuộm tối ƣu là 73,9% ở các điều kiện kiện nhuộm:
pH môi trường: 8;
Nồng độ cơ chất: 1,0mg/1ml;
Lƣợng dung môi DMF: 0,6ml
Thời gian nhuộm: 30 phút;
Nhiệt độ môi trường: 37oC.
Để khẳng định các điều kiện thí nghiệm đã nằm trong miền tối ƣu, tiến hành 3 thí nghiệm lặp ở đỉnh này và thu đƣợc kết quả đƣợc trình bày trên bảng 3.5.
Bảng 3.5. Hiệu suất thu đƣợc ở vùng tối ƣu
Số thí nghiệm Điểm số (Y) Hiệu suất %
1 290 72,5%
2 285 71,25%
3 292 73%
Trung bình 289 72,25%
Qua kết quả nghiên cứu cho thấy:
Về pH của môi trường nhuộm: Kết quả thực nghiệm cho thấy pH tối ưu 8.
Đây là môi trường thích hợp bởi phản ứng giữa Naphtol AS propanoate và Fast red violet LB salt xảy ra càng nhanh khi mật độ electron ở vị trí C4 của vòng naphtol càng cao. Mật độ electron cao khi nhóm OH tồn tại ở trạng thái tự do hoặc dưới dạng anion. Nếu trong môi trường có pH thấp, nhóm OH dễ bị proton hóa sẽ làm
46
giảm mật độ electron và giảm tốc độ phản ứng. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Dacie và Lewis [26], tác giả J. Clayen, L. Bitesky và Butcher cho rằng cơ chất nhuộm phát hiện enzyme esteraza không đặc hiệu hoạt động tốt trong vùng pH = 7- 8,5; song cao hơn so với điều kiện nhuộm của hãng Sigma (pH = 6,6) [27].
Về hàm lƣợng cơ chất: Tốc độ phản ứng thủy phân bởi enzyme tỉ lệ thuận với nồng độ cơ chất tham gia, muốn cho tốc độ phản ứng thủy phân đạt cực đại thì nồng độ cơ chất phải lớn hơn khoảng 100 lần hằng số Michaelis [20]. Tại thời điểm cân bằng đó mọi enzyme đều kết hợp với cơ chất. Tuy nhiên, mỗi enzyme chỉ thủy phân một số lƣợng phân tử cơ chất nhất định sau đó hoạt tính bị giảm dần. Mặt khác, cơ chất là một este nên khả năng tan trong nước là rất hạn chế. Do đó nếu tăng nồng độ cơ chất lên quá cao thì rất dễ xảy ra hiện tƣợng kết tủa, enzyme không tiếp xúc đƣợc với cơ chất gây lãng phí, Quá trình nghiên cứu phản ứng nhuộm tìm thấy hàm lƣợng cơ chất Naphtol AS propanoate là 1,0mg/1ml, vẫn cần đƣợc khảo sát mở rộng hơn.
Thời gian phản ứng: Tại điều kiện tối ƣu tìm đƣợc khoảng thời gian nhuộm giảm xuống còn 30 phút, ngắn hơn 1 nửa so với quy trình của hãng Sigma-Aldrich (60 phút) [27]. Có thể giải thích thời gian phản ứng giảm do tăng nhiệt độ của môi trường phản ứng theo quy luật khi tăng nhiệt độ lên 10oCthì tốc độ phản ứng tăng 2-4 lần [20].
Kết quả nghiên cứu đã xây dựng đƣợc quy trình nhuộm tối ƣu nhƣ sau:
Pha chế dung dịch nhuộm - Dung dịch cố định:
Axít Xitric 58,1 mg
Natri xitrat 86,4 mg
Natri clorua 17,4 mg
H2O vừa đủ 25,0 ml
Axeton 99,5% 65 ml
Focmaldehyt 8,0 ml