a. Tổng hợp theo phương pháp truyền thống [7].
Hòa tan 1g (0,00343 mol) naphtol AS-OL vào trong 10 ml THF. Nhỏ từ từ 0,648 ml dung dịch NaOH 5M vào dung dịch trên và duy trì nhiệt độ phản ứng ở 0oC. Sau đó tiếp tục nhỏ từ từ 0,343 ml butanoyl clorua lạnh 98% d= 1,026 (g/ml) vào dung dịch trên và khuấy trong thời gian 1 h. Kết thúc phản ứng, thêm nước lạnh vào lọc thu sản phẩm thô. Kết tinh sản phẩm trong dung môi axeton và etanol (tỉ lệ 3:1 v/v), tinh thể đƣợc hình thành sau 48h. Sắc ký bản mỏng có một chấm (Rf= 0,69 dung môi n-hexan:etylaxetat = 3:7 v/v), Tnc: 94-96oC (94-95 oC [7]). Hiệu suất đạt 52%.
Hiệu suất thu đƣợc sau phản ứng chƣa cao do đó đã tiến hành khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng: Nhiệt độ, dung môi, tỉ lệ chất tham gia và thời gian phản ứng.
b. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng tổng hợp: dẫn suất este 3-(N- phenyl)nahthalen-2-yl cacboxylat.
b.1. Khảo sát sự ảnh hưởng của dung môi
Giữ nguyên điều kiện phản ứng ở nhiệt độ 0oC, tỉ lệ tỷ lệ Naphtol AS-OL:
butanoyl clorua = 1: 1,1, thời gian phản ứng 1 giờ; thay đổi dung môi hòa tan NaOH trước khi nhỏ vào phản ứng bằng các dung môi khảo sát: THF, axeton; acetonitrin, DMF, DMSO và etylenglycol monometyl ete (EGME). Các dung môi đƣợc sử dụng khảo sát đều được làm khan trước khi tiến hành thí nghiệm. Phản ứng được tiến hành trong các điều kiện tương tự phương pháp truyền thống (mục 2.6.1.a). Kết quả khảo sát đƣợc trình bày trên bảng 2.1.
Bảng 2.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến hiệu suất của phản ứng Dung môi
phản ứng
THF Axeton DMSO EGME axetonitrin DMF
H(%) 52,0 30,2 40,5 66,8 48,6 32,1
23
Khi sử dụng dung môi EGME cho hiệu suất cao nhất, do đó yếu tố này là cố định để khảo sát các yếu tố khác ảnh hưởng đến phản ứng.
b.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của tỉ lệ chất tham gia phản ứng
Phản ứng được tiến hành trong các điều kiện tương tự phương pháp truyền thống (mục 2.6.1.a), nhiệt độ phản ứng 00C, dung môi etylenglycol monnometyl ete, tỷ lệ Naphtol AS-OL : butanoyl clorua thay đổi nhƣ sau: 1:1,1; 1:1,2; 1: 1,3; 1 : 1,5 và 1 : 2. Kết quả khảo sát đƣợc trình bày trên bảng 2.2.
Bảng 2.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ chất tham gia phản ứng đến hiệu suất của phản ứng
Tỷ lệ chất tham gia phản ứng
1:1,1 1:1,2 1 : 1,3 1 : 1,5 1 : 2
H(%) 66,8 67,2 68,8 69,1 69,3
Tỷ lệ Naphtol AS-OL : butanoyl clorua =1:1,5 và 1:2 cho hiệu suất không chênh lệch nhiều so với tỷ lệ 1:1,3. Nên tỷ lệ Naphtol AS-OL : butanoyl clorua
=1:1,3 được chọn làm yếu tố cố định để khảo sát các ảnh hưởng khác đến phản ứng.
b.3. Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đối với hiệu suất phản ứng
Do cơ chất rất không bền ở nhiệt độ trên >-20oC [24], do đó đã tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất sản phẩm. Phản ứng được thực hiện trong tủ ẩm lạnh MIR-154 để duy trì nhiệt độ ổn định tròn suốt quá trình. Phản ứng đƣợc tiến hành trong các điều kiện dung môi etylenglycol monnometyl ete, tỷ lệ Naphtol AS-OL : butanoyl clorua = 1:1,3, thời gian phản ứng 1 giờ, nhiệt độ khảo sát ở 10, 5, 0, -5 và -10oC. Sau khi xử lý hiệu suất sản phẩm 3b3 đƣợc trình bày trên bảng 2.3.
Bảng 2.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiệu suất của phản ứng Nhiệt độ
phản ứng
100C 50C 00C -50C -100C
H(%) 69,5 69 68,8 65 60
Ở nhiệt độ 00C, phản ứng cho hiệu suất cao nhất, do đó nhiệt độ này đƣợc chọn là nhân tố cố định tiếp theo để khảo sát các yếu tố khác.
24
b.4. Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian phản ứng
Giữ nguyên điều kiện phản ứng ở nhiệt độ 0oC, dung môi sử dụng etylenglycol monnometyl ete, tỷ lệ chất tham gia phản ứng: Naphtol :cacboxyl clorua = 1: 1,3; thời gian phản ứng thay đổi từ 1h; 1,5h; 2h; 2,5h; 3h. Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian phản ứng đƣợc thể trình bày trên bảng 2.4.
Bảng 2.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hiệu suất Thời gian
phản ứng (h)
1,0 1,5 2 2,5 3
H(%) 68,8 72 80 80,3 80,5
Thời gian 2h cho hiệu suất cao nhất, kéo dài thời gian hiệu suất khoogn tăng lên đáng kể. Do đó, thời gian tối ƣu đƣợc chọn là 2h.
Sau khi khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng, đã tìm được điều kiện thích hợp để sản phẩm Naphtol AS-OL butanoat (3b3) đạt hiệu suất cao nhất (80%) là:
+ Dung môi etylenglycol mono metyl ete;
+ Tỷ lệ chất tham gia phản ứng: Naphtol : cacboxyl clorua = 1:1,3;
+ Nhiệt độ phản ứng ở 0oC;
+ Thời gian phản ứng: 2h.
Bằng quy trình tương tự đã tổng hợp được 10 este 3-[(N-phenyl) cacbamoyl]
naphtalen-2-yl cacboxylat:
3-(phenylcarbamoyl)naphthalen-2-yl axetat, hiệu suất 62% (NaOH 5M); Tnc
= 160-1620C; sắc ký bản mỏng có một chấm (Rf= 0,60 dung môi n- hexan:etylaxetat = 3:7) (3a1);
3-(phenylcarbamoyl)naphthalen-2-yl propanoat, hiệu suất 69% (NaOH 5M);
Tnc = 154-1560C; sắc ký bản mỏng có một chấm (Rf= 0,62 dung môi n- hexan:etylaxetat = 3:7) (3a2) chất mới;
3-(phenylcarbamoyl)naphthalen-2-yl butanoat, hiệu suất 72% (NaOH 5M);
Tnc = 146-1470C; sắc ký bản mỏng có một chấm (Rf= 0,61 dung môi n- hexan:etylaxetat = 3:7) (3a3);
3-(phenylcarbamoyl)naphthalen-2-yl pentanoat, hiệu suất 67% (NaOH 5M);
Tnc = 135-1360C; sắc ký bản mỏng có một chấm (Rf= 0,65 dung môi n- hexan:etylaxetat = 3:7) (3a4);
25
3-[(2-Methoxylphenyl)cacbamoyl]naphtalen-2-yl axetat, hiệu suất 65%
(NaOH 5M); Tnc = 130-1310C; sắc ký bản mỏng có một chấm (Rf= 0,63 dung môi n-hexan:etylaxetat = 3:7) (3b1);
3-[(2-Methoxylphenyl)cacbamoyl]naphtalen-2-yl propanoat, hiệu suất 71 % (NaOH 5M); Tnc = 107-1090C; sắc ký bản mỏng có một chấm (Rf= 0,65 dung môi n-hexan:etylaxetat = 3:7) (3b2);
3-[(2-Methoxylphenyl)cacbamoyl]naphtalen-2-yl butanoate, hiệu suất 80%
(NaOH 5M); Tnc = 95-960C; sắc ký bản mỏng có một chấm (Rf= 0,69 dung môi n-hexan:etylaxetat = 3:7) (3b3);
3-[(2-Methoxylphenyl)cacbamoyl]naphtalen-2-yl pentanoat, hiệu suất 73%, (NaOH 5M); Tnc = 89-910C; Sắc ký bản mỏng có một chấm (Rf= 0,71 dung môi n-hexan:etylaxetat = 3:7) (3b4);
3-[(5-chloro-2-methoxyphenyl)carbamoyl]naphthalen-2-yl axetat, hiệu suất 65%, (NaOH 5M); Tnc = 168-1700C; Sắc ký bản mỏng có một chấm (Rf= 0,60 dung môi n-hexan:etylaxetat = 3:7) (3c1) chất mới;
3-[(5-chloro-2-methoxyphenyl)carbamoyl]naphthalen-2-yl butanoat, hiệu suất 68%, (NaOH 5M); Tnc = 141-1430C; Sắc ký bản mỏng có một chấm (Rf= 0,63 dung môi n-hexan:etylaxetat = 3:7) (3c2);
2.6.2. Quy trình thực nghiệm tối ƣu hóa phản ứng nhuộm enzym.
a. Chuẩn bị dung dịch nhuộm - Dung dịch cố định:
+ Axít citric 58,1 mg
+ Natri xitrat 86,4 mg
+ Natri clorua 17,4 mg + H2O vừa đủ 25,0 ml
+ Axeton 99,5% 65 ml
+ Focmaldehyt 8,0 ml - Thành phần dung dịch nhuộm:
+ Dung dịch cơ chất pha trong DMF + Dung dịch fast red violet LB salt + Dung dịch đệm
b. Quy trình nhuộm chung:
Bước 1: Cố định tiêu bản trong dung dịch cố định trong thời gian 10 giây;
26
Bước 2: Phủ dung dịch nhuộm lên tiêu bản, sau đó để tiêu bản dưới vòi nước chảy trong 5 phút;
Bước 3: Nhuộm nhân và nền bằng Hematoxylin trong thời gian 5 phút, sau đó để tiêu bản dưới vòi nước chảy trong 5 phút; để khô và đánh giá kết quả.
Đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng thông qua phản ứng dương tính hoặc âm tính đối với tế bào bạch cầu mono: dương tính khi xuất hiện các hạt bắt màu đỏ trên nền nguyên sinh chất tế bào, nhân tế bào bắt màu xanh; ngƣợc lại không có màu đỏ là âm tính.
Đánh giá độ nhạy và mức độ dương tính theo kỹ thuật của hãng Sigma Độ 0: Không có hạt bắt màu thuốc nhuộm;
Độ 1: Ít hạt trên nguyên sinh chất, hạt mịn nhỏ, chiếm ≤ 1/3 bào tương của tế bào;
Độ 2: Số hạt bắt màu trờn nguyờn sinh chất, hạt trung bỡnh, chiếm > 1/3 đến < ắ bào tương của tế bào;
Độ 3: Số hạt bắt màu trên nguyên sinh chất, hạt to, chiếm hết bào tương của tế bào;
Độ 4: Nhiều hạt phủ kín nguyên sinh chất và nhân, hạt to.
Điểm nhuộm đƣợc tính theo công thức:
∑Y (điểm) = Y0 x 0 + Y1 x 1 + Y2 x 2 + Y3 x 3 + Y4 x 4
Sử dụng cơ chất Naphtol AS propanoat làm cơ chất thực nghiệm. Tiến hành khảo sát nghiên cứu trên 5 yếu tố: thời gian nhuộm, pH dung dịch đệm, nồng độ cơ chất, hàm lƣợng DMF và nhiệt độ theo bảng 2.5 và 2.6.
Bảng 2.5. Các nhân tố và mức đƣợc xét trong mô hình thực nghiệm Nhân tố Ký hiệu Mức mã hóa
Thấp (−) Cao (+)
pH dung dịch đệm A 6 8
Hàm lƣợng DMF (uL) B 0,6 1,0
Nồng độ cơ chất (mg) C 0,6 1,0
Nhiệt độ (oC) D 25 37
Thời gian nhuộm (phút ) E 30 90
27
Bảng 2.6. Bảng ma trận mô hình mẫu nhân tố thực nghiệm TT pH dung dịch
đệm Hàm lƣợng DMF – mL
Nồng độ cơ
chất - mg Nhiệt độ -
oC
Thời gian nhuộm - phút
1. 1 6 0,6 1,0 25 30
2. 3 6 0,6 1,0 37 90
3. 4 6 0,6 0,6 25 30
4. 5 6 0,6 0,6 37 30
5. 6 6 0,6 1,0 37 30
6. 9 8 1,0 1,0 25 30
7. 1 6 0,6 0,6 25 90
8. 1 8 0,6 1,0 25 90
9. 1 8 0,6 1,0 25 30
10. 1 6 1,0 0,6 37 30
11. 1 8 1,0 1,0 37 30
12. 2 6 1,0 0,6 25 90
13. 2 6 0,6 0,6 37 90
14. 2 8 1,0 0,6 25 30
15. 2 8 0,6 0,6 37 90
16. 2 6 1,0 0,6 25 30
17. 8 0,6 0,6 25 30
18. 8 1,0 1,0 25 90
19. 8 1,0 1,0 37 90
20. 6 1,0 1,0 25 30
21. 8 1,0 0,6 37 90
22. 8 0,6 0,6 37 30
23. 8 0,6 0,6 25 90
24. 8 0,6 1,0 37 90
25. 8 1,0 0,6 37 30
26. 6 1,0 1,0 37 90
27. 8 0,6 1,0 37 30
28. 6 1,0 0,6 37 90
29. 8 1,0 0,6 25 90
30. 6 0,6 1,0 25 90
31. 6 1,0 1,0 37 30
32. 6 1,0 1,0 25 90
28
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Nhƣ đã đề cập trong phần tổng quan, 3-[(N-phenyl thế)carbamoyl]naphtalen- 2-yl cacboxylat là tên khoa học của các chất có tên thương mai là Naphtol AS-thế cacboxylat [25] có công thức cấu tạo chung nhƣ sau:
8
5 7
6
1 2
4 3
NH
1' 6'
2' 5'
3' 4'
O
OCOR
Y
X
R: Alkyl; X và Y: H, OCH3, Cl,…
Phần lớn các dẫn xuất đề đƣợc ứng dụng chủ yếu trong nghiên cứu nhuộm tế bào, cho đến nay người ta chỉ sử dụng một số dẫn xuất chứa nhóm nhóm thế monophenyl (o,p-X-Aryl). Cơ chất nhuộm esteraza không đặc hiệu bạch cầu người được thương mại hóa nhiều nhất là naphtol AS axetat (R = CH3, X = Y = H). Tuy nhiên kết quả nhuộm esteraza dòng mono không đặc hiệu bạch cầu người gồm 2 kỹ thuật nhuộm có và không có chất ức chế NaF vẫn đƣợc triển khai rộng rãi, khi sử dụng cơ chất này cùng với các kỹ thuật nhuộm hóa học tế bào khác thời gian nhuộm kéo dài và khi phân loại dòng tế bào trong bệnh bạch cầu cấp theo tiêu chuẩn FAB có sự chênh lệch so với phương pháp di truyền và phương pháp đánh dấu đến 29,7% [7]. Nguyên nhân có thể là do độ nhạy, độ đặc hiệu của các kỹ thuật nhuộm hóa học tế bào trong đó có kỹ thuật nhuộm esteraza không đặc hiệu với việc sử dụng cơ chất naphtol AS axetat chƣa cao. Độ nhạy, độ đặc hiệu của phản ứng nhuộm esteraza không đặc hiệu bạch cầu người phụ thuộc vào cấu trúc của cơ chất sử dụng và điều kiện tiến hành nhuộm. Một trong những nguyên nhân lệch chuẩn có lẽ vì việc nghiên cứu chƣa có hệ thống; một mặt, các nhà nghiên cứu quá tập trung chú ý vào một số dẫn xuất phổ biến, riêng lẻ dùng làm cơ chất cho phản ứng nhuộm; mặt khác, do chưa tìm được phương pháp có hiệu quả kinh tế cao để tổng hợp cơ chất.