Hiện tại có ba kỹ thuật để phân loại dòng tế bào trong bệnh bạch cầu cấp, một là phương pháp miễn dịch (maker), hai là phương pháp di truyền, và ba là phương pháp nhuộm hóa học. Nhuộm hóa học tế bào là các kỹ thuật nhuộm nhằm phát hiện các chất hóa học có trong tế bào bằng phương pháp lên màu và quan sát bằng kính hiển vi quang học. Hiện nay, bằng phương pháp nhuộm hóa học tế bào có thể phát hiện đƣợc nhiều loại hợp chất hóa học khác nhau. Nhuộm esteraza là thực hiện phản ứng tạo màu giữa các hóa chất dưới tác dụng xúc tác thủy phân của esteraza để phát hiện các esteraza có trong tế bào.
Nhuộm eteraza gồm 2 kỹ thuật nhuộm esteraza đặc hiệu và không đặc hiệu, Tính đặc hiệu của cơ chất naphtol AS-D cloaxetat và AS axetat vẫn là cơ sở giúp phân loại bạch cầu hạt và bạch cầu mono trong bệnh bạch cầu cấp dòng tủy.
Esteraza không đặc hiệu dương tính trong tất cả các dòng tế bào máu vì thế nên đƣợc gọi là không đặc hiệu [7].
Cơ chế phản ứng thủy phân dựa trên cơ chế hình thành phẩm màu azo giống nhƣ nhuộm esteraza đặc hiệu [18, 26].
48
Giai đoạn 1: Esteraza bạch cầu người thủy phân cơ chất là các este tạo thành dẫn xuất của naphtol:
NH O
OCOR Y
X
Esteraza/H2O RCOOH
NH O
OH
Y
X
Giai đoạn 2: Dẫn xuất naphtol tác dụng với muối điazo tạo thành chất màu azo:
NH CH3
Cl O
N+ N
+
4 OH
O NH
Y
X
4 OH
O
NH
NH CH3
Cl
O N
N
Y
X
Kết quả là các vùng có esteraza sẽ xuất hiện các hạt bắt màu đỏ với cường độ khác nhau. Đánh giá kết quả bằng phương pháp đếm tế bào có nhân rồi tính điểm theo kỹ thuật của hãng Sigma và phân độ theo FAB. Hoạt tính cơ chất nhuộm esteraza không đặc hiệu bạch cầu người được đánh giá theo hai tiêu chí, một là độ đặc hiệu, hai là độ nhạy.
- Độ đặc hiệu của cơ chất là khả năng phản ánh đúng thực trạng tế bào: có esteraza dòng mono phải dương tính, không có phải âm tính;
- Độ nhạy của cơ chất là giới hạn phát hiện esteraza đặc hiệu trong tế bào bạch cầu, giới hạn phát hiện càng nhỏ thì độ nhạy càng cao. Cơ chất có độ nhạy càng cao thì điểm nhuộm càng cao.
Kết quả độ đặc hiệu của các cơ chất alkyl cacboxylat trong kỹ thuật nhuộm esteraza bạch cầu dòng mono đƣợc thể hiện trên bảng 3.6.
49
Bảng 3.6. Độ nhạy và độ đặc hiệu của các cơ chất 3-[(N-phenyl thế) cacbamoyl]naphtalen-2-yl cacboxylat tổng hợp đƣợc
Loại tế bào Kết quả nhuộm
Bạch cầu đa nhân trung tính Âm tính hoặc dương tính nhẹ
Bạch cầu ƣa axit Âm tính
Bạch cầu ái kiềm Âm tính
Bạch cầu monoxit Dương tính
Bạch cầu lymphoxit Âm tính
Tiểu cầu Âm tính
Hồng cầu Âm tính
Trong kỹ thuật nhuộm esteraza đặc hiệu thì dẫn xuất nhuộm tốt nhất là các naphtol AS cacboxylat có nhóm thế đẩy điện tử ở vị trí -octo, nguyên tử clo ở vị trí α và có 3 nguyên tử cacbon trong hợp phần axít. Đối với kỹ thuật nhuộm esteraza không đặc hiệu thì tốt nhất hiện nay là các naphtol cacboxylat không có chứa nguyên tử halogen ở vị trí α và có 2-4 nguyên tử cacbon ở hợp phần gốc axit. Các cơ chất dùng phổ biến hiện nay là naphtyl butanoat và naphtol AS axetat [7].
Kết quả của điểm nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu dòng mono đƣợc tổng hợp trong bảng 3.7 và hình 3.10-3.13.
Bảng 3.7. Điểm nhuộm của các naphtol AS thế cacboxylat
Chất X Y R1 Điểm
3a1 H H CH3 (Sigma) 250
3a2 H H CH3CH2 285
3a3 H H CH3CH2CH2 220
3a4 H H CH3CH2CH2CH2 160
3b1 OCH3 H CH3 150
3b2 OCH3 H CH3CH2 100
3b3 OCH3 H CH3CH2CH2 180
3b4 OCH3 H CH3CH2CH2CH2 98
3c1 OCH3 Cl CH3 120
3c3 OCH3 Cl CH3CH2CH2 70
50 Hình 3.10. Ảnh nhuộm naphtol AS
propanoat
Hình 3.11. Ảnh nhuộm naphtol AS- CA axetat
Hình 3.12. Ảnh nhuộm naphtol AS axetat không có chất ức chế NaF
Hình 3.13. Ảnh nhuộm naphtol AS axetat có chất ức chế NaF Kết quả trên bảng 3.7 cho thấy các 3-[(N-phenyl thế)-cacbamoyl]naphtalen- 2-yl cacboxylat tổng hợp đƣợc có hoạt tính sinh học khi sử dụng làm cơ chất nhuộm esteraza đặc hiệu bạch cầu người dòng monoxit. Trong đó naphtol AS propanoat có độ nhạy cao hơn so với cơ chất Naphtol AS axetat đang đƣợc sử dụng hiện nay. Đặc biệt, quá trình nhuộm bằng cơ chất naphtol AS propanoat cho kết quả nhuộm đặc hiệu với dòng mono. Nhƣ vậy, có thể dùng naphtol AS propanoat làm cơ chất cho phản ứng nhuộm esteraza đặc hiệu phát hiện tế bào dòng monoxit thay thế cơ chất nhập ngoại naphtol AS axetat hiện nay với giá thành rẻ hơn rất nhiều lần. Từ đó có thể giảm chi phí giá thành nhập ngoại cơ chất cho Việt Nam.