Rai M.K và cộng sự [30] định lƣợng PQ sử dụng NaBH4 để khử PQ trong môi trường kiềm tạo ra dung dịch màu xanh hấp thụ cực đại ở bước sóng 600nm trong khi Kato K. và cộng sự [20] lại dùng Tetrabromophenolphthalein Ethyl Ester (TBPE) phản ứng với PQ để tạo ra dung dịch hữu cơ PQ-TBPE màu xanh da trời, có thể chiết đƣợc bằng dichloromethane. Chang-bin Li và cộng sự [24] đã định lượng PQ trong huyết tương dựa bằng đo quang phổ của dẫn xuất khi phản ứng với Na2S2O4 10% và NaOH 5M.
Ưu điểm của phương pháp khử PQ bằng NaBH4 là độ nhạy cao, với các điều kiện khử PQ là nhiệt độ 35-40°C, pH 10-11 thì màu có độ ổn định lên đến 12h và khụng cần đệm để ổn định màu, khoảng nồng độ 0,05 - 0,5 àg/ml tuõn theo định luật Lambert – Beer, trong khi giới hạn phỏt hiện là 0,03 àg/ml. Trong khi đú, phương pháp sử dụng TBPE thì mẫu được phép để tối đa trong 20 phút. Cả 2 phương pháp này đều đề cập đến DQ, trong khi Rai M.K [30] loại bỏ DQ thì Kato K. [20] lại định lƣợng đồng thời cả PQ và DQ.
Phương pháp định lượng PQ bằng NaBH4 đã loại được sự ảnh hưởng của các thuốc trừ sâu thông thường và các ion kim loại khác. DQ, có cấu trúc gần giống PQ, sẽ gây ảnh hưởng khi định lượng PQ. Tuy nhiên DQ, nếu có, sẽ bị loại khi thêm NaOH 0,2 N, trong khi PQ không bị mất đi. Các ion kim loại nhƣ Fe3+ và Al3+, có thể ảnh hưởng do làm kết tủa hydroxide, sẽ bị loại đi khi thêm 1 ml Natri EDTA 5%
trước khi thêm dung dịch NaOH [30]. Còn theo Kato K [20], DQ cũng có thể chiết đƣợc với TBPE trong dichloromethane cũng giống nhƣ PQ nhƣng PQ-TBPE có quang phổ hấp thụ hơi khác với DQ-TBPE. Đo độ hấp phụ của PQ ở bước sóng 603 nm & DQ ở bước sóng 608 nm với dãy nồng độ (4,5 - 45,0)×10-7 M. Giới hạn phát hiện 4,77.10-7 M.
Phương pháp định lượng PQ bằng NaBH4 đã được ứng dụng để định lượng PQ trong mẫu bệnh phẩm bệnh nhân như máu, nước tiểu, sữa mẹ cũng như các mẫu thực phẩm và các mẫu trong môi trường.
Với phương pháp đo quang phổ thông thường, không phát hiện được PQ tại bước sóng 257 nm. Nên Chang-bin Li và cộng sự [24] đã định lượng nồng độ PQ trong huyết tương dựa trên việc đo quang phổ dẫn xuất thứ 2 (tuân theo định luật Lambert Beer với r = 0,996). Dung dịch nước chuẩn PQ 10 μg/ml được quét bước sóng từ 200 đến 300 nm, với mẫu trắng là nước cất. Huyết tương sạch và các dung dịch huyết tương chuẩn PQ 50 và 10 μg/ml được thêm TCA 20% (tỉ lệ 6:1, v/v).
Lắc xoáy, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút. Lấy dịch trong phần trên đi đo quét bước sóng từ 200 đến 300 nm. Sau khi xử lý mẫu như trên, dịch trong phần trên được chuyển vào ống Eppendorf mới, bảo quản tránh ánh sáng. Trước khi đo, 400 μl mẫu đƣợc lắc trộn nhẹ nhàng và hoàn toàn với 100 μl hỗn hợp đồng thể tích Na2S2O4 10% và NaOH 5M. Làm tương tự với mẫu huyết tương trắng đối chiếu và đo độ hấp thụ quang trong khoảng bước sóng từ 300 đến 500 nm (khoảng bước sóng Δλ = 0,5 nm). Từ đó dẫn xuất thứ 2 này có thể đƣợc tính toán theo công thức Δ2Abs/(Δλ)2 (khoảng bước sóng dẫn xuất Δλ=4 nm) [24].
1.2.2. Phương pháp sắc ký khí khối phổ
Phương pháp GC-MS là phương pháp đơn giản có độ nhạy và độ tin cậy cao, từ lâu đã đƣợc sử dụng để định lƣợng PQ trong dịch sinh học. L. Gao [16] và Almeida R. M. [5] cùng sử dụng phương pháp GC-MS để định lượng PQ. Trong cả hai nghiên cứu, các tác giả đã sử dụng hệ thống chọn lọc ion (selected ion monitoring – SIM) để nhận biết PQ, đồng thời cũng thêm EPQ làm chất nội chuẩn, khí He đƣợc dùng nhƣ là khí mang để đƣa chất phân tích vào cột. Dung dịch mẫu
phân tích đều được khử bằng NaBH4 trước khi đem phân tích trên hệ sắc ký khí.
Tuy nhiên mỗi tác giả lại nghiên cứu các quy trình phân tích khác nhau.
Tác giả L. Gao và cộng sự [16] lại sử dụng cột mao quản (10 m × 0,18 mm, độ dày màng 0,25 àm). Nhiệt độ của bơm tiờm, interface và nguồn ion lần lƣợt là 280, 280, 200oC. Khí mang đƣợc bơm đẳng dòng với tốc độ là 1,01 ml/phút. Mẫu đƣợc đƣa vào bằng chế độ tiêm chia dòng (10:1) và nhiệt độ giải hấp phụ lúc đầu là 70oC trong 1 phút và tăng đến 295oC với tốc độ 25oC/phút. Nhiệt độ 295oC đƣợc duy trì trong 10 phút. Trong đó các mảnh ion 196 và 224 đƣợc dùng để định lƣợng PQ & EPQ. Độ thu hồi của mẫu máu và nước tiểu lần lượt là 94,00 - 99,85% và 95,00 - 100,34%, khoảng tuyến tớnh 0,1 - 50 àg/ml. Giới hạn phỏt hiện (S/N = 3) là 0,01 àg/ml đối với cả mỏu và nước tiểu. Phương phỏp này đó được ỏp dụng để phõn tích các mẫu sinh học thu đƣợc từ các nạn nhân chết do uống PQ.
Trong khi đó, Almeida R. M. và cộng sự [5] sử dụng trên hệ máy sắc ký GC- MS (Gas chromatograph model 6890 và Mass selective detector MSD model 5972) với cột mao quản fused-silica HP-5MS (30 m × 0,25 mm, độ dày màng phim 0,1 àm) và chế độ đẳng dũng với tốc độ 0,6 ml/phỳt. Nhiệt độ của bơm và interface (bộ phận ghép nối giữa GC và MS) là 270oC. Bơm hoạt động ở chế độ chia dòng. Nhiệt độ cột duy trì 80oC trong 1 phút, tăng nhiệt 10oC/phút đến 200oC và 20oC/phút đến 270oC và duy trì 270oC trong 4 phút. Số khối của các mảnh ion đƣợc chọn cho các hợp chất là: m/z 108, 135, 190 (DQ); m/z 134, 148, 192 (PQ) và m/z 148, 162, 220 (EPQ), trong đó các mảnh ion 192 và 162 đƣợc dùng để định lƣợng PQ & EPQ.
1.2.3. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ
Hai tác giả ZhaohongWang và Proenca P. đều định lƣợng PQ trong mẫu sinh học bằng sắc ký lỏng - ion hóa tia điện - khối phổ [28] [41].
ZhaohongWang sử dụng hệ thống Waters UPLC với. Tiêm mẫu 5 μl với cột ACQUITY BEH HILIC (50 mm × 2,1 mm × 1.7 μm) ở 30oC. Còn Proenca P. sử dùng hệ thống sắc ký LC Water 2695 Alliance System và cột silica HILIC (150 × 2,1 mm ì 5 àm). Nhiệt độ cột duy trỡ 35oC. Bơm mẫu 10 àl. Detector mảng
photodiode Water 996 hoạt động từ bước sóng 210-400 nm với độ phân giải 1,2 nm.
Độ hấp thụ UV đƣợc đo ở 258 nm.
Cả hai tác giả đều sử dụng pha động là ammonium formate và acetonitrile.
Trong khi ZhaohongWang dùng ammonium formate 250 mM (điều chỉnh đến pH 3,7 bằng acid formic) và acetonitrile. Và chạy pha động theo chế độ gradient với tốc độ dòng 0,3 ml/phút. Ngay sau khi tiêm mẫu, % acetonitrile giảm từ 60% đến 20%
trong 0,5 phút, sau đó tăng tới 60% ở 1,5 phút và duy trì 60% ở 1,5 phút tiếp. Tổng thời gian chạy là 3 phút. Thì tác giả Proenca P. dùng pha động gồm acetonitrile và đệm ammonium formate (200 mM) pH 3,6 với chế độ đẳng dòng (30:70, v/v) và tốc độ 300 àl/phỳt.
Các tác giả trên đều sử dụng nguồn ion hóa tia điện dương để ion hóa PQ và chuẩn nội nhƣng có khác nhau về điều kiện khối phổ.
Tác giả ZhaohongWang sử dụng bộ phân tích phổ khối ACQUITY BSM_SM_Quattro Premier XE MS. Tối ƣu hóa điều kiện MS-MS bằng cách tiêm dòng PQ và ethyl viologen trong acetonitrile/dung dịch ammonium formate 250 mM (40:60, v/v) với tốc độ khí cone là 50 l/h và tốc độ dòng khí làm khô là 651 l/h ở 350oC. Điện áp mao quản là 3,5 kV và điện áp cone là 20 V, điện áp extractor là 4,0 V và điện áp thấu kính RzFl à 0,5 V. Định lƣợng bằng kỹ thuật quét ion (multi- reaction monitoring, MRM), bắt các mảnh ion ban đầu có m/z 186 và các ion sản phẩm có m/z 155 và 171 đối với PQ; mảnh ion ban đầu có m/z 214 và các ion sản phẩm có m/z 158 và 185 đối với chuẩn nội ethyl viologen [41].
Còn với tác giả Proenca P [28] phát hiện phổ (MS) đƣợc thực hiện trên máy khối phổ tƣ́ cực Water ZQ 2000. Thiết lập các điều kiện: nguồn nhiệt 120oC; nhiệt độ làm khô 400oC; tốc độ dòng khí cone (N2) 0 l/h và tốc độ dòng khí làm khô (N2) 600 l/h. Điện thế capillary 3,5 kV; điện thế cone 40 V; extractor 4 V; năng lƣợng ion 0,5 V; Quét phổ từ m/z 130-500, thời gian quét 0,5 s và thời gian trễ (interscan) 0,1s. Đường chuẩn độ PQ trong mỏu tuyến tớnh từ 0,010-2,0 àg/ml trong mỏu (y=0,0142x+0,1497 với r2=0,9994) và tuyến tớnh từ 0,025-10,0 àg/ml trong nước tiểu (y = 0,0141x + 1,347 với r2 = 0,9994). Giới hạn phát hiện của PQ trong máu và
nước tiểu lần lượt là 0,004 àg/ml và 0,007 àg/ml (LOD, S/N = 3) và giới hạn định lượng (LOD, S/N = 10) là 0,0012 àg/ml trong mỏu và 0,024 àg/ml trong nước tiểu.
Nghiên cứu cũng chứng minh mẫu máu trắng không có pic nào trùng thời gian lưu với PQ và chất chuẩn nội
1.2.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Có rất nhều tác giả đã sử dụng phương pháp HPLC để định lượng PQ trong dịch sinh học [7][17][26].
Arys K. và cộng sự [7] sử dụng hệ thống HPLC. Gồm bơm model 126 và tiờm mẫu type 210A với vũng tiờm mẫu 50 àl. Bước súng hoạt động là 230 nm.
Cột phân tích Aluspher 100 RP-select B (125 mm × 4,0 mm, kích thước hạt 5 àm) với cột bảo vệ 100 RP-select B (4 mm ì 4,0 mm, kớch thước hạt 5 àm). Pha động là hỗn hợp dung dịch NaOH 0,0125 M trong nước (dung dịch A) và dung dịch NaOH 0,0125 M trong methanol (dung dịch B), tốc độ dòng 1 ml/phút.
Chạy pha động chế độ gradient, dung dịch A từ 90% đến 10% trong thời gian 15 phút. Sau khi chạy xong, chạy lại điều kiện ban đầu trong 5 phút trước khi chuyển sang chạy mẫu mới. Giới hạn phát hiện PQ của phương pháp trong máu và nước tiểu lần lượt là 63 và 32 àg/l.
Paixão P. [26] định lượng PQ trong huyết thanh và huyết tương người được làm đơn giản và nhanh bằng phương pháp HPLC sử dụng 1,19-diethyl-4,49- bipyridyldiylium (diethyl paraquat) làm nội chuẩn. Hệ thống HPLC gồm bơm mẫu model 1100, ổn định nhiệt, detector UV-VIS. Vũng bơm mẫu 50 àl, cột NovaPar C18 (150ì4,6 mm, 5àm). Tiền cột C18 (100ì4,6 mm, 10àm). PQ và chất nội chuẩn được rửa giải ở 25oC với tốc độ dòng 0,8 ml/phút và bước sóng hấp thụ 258 nm.
Pha động gồm acid 1 - octanesulphonic 3,0 mM; acid orthophosphoric 0,1 M trong 900 ml nước khử khoáng điều chỉnh pH đến 3,0 bằng diethylamine. Acetonitrile nồng độ 10% (v/v). Kết quả: Thời gian lưu của PQ và chuẩn nội là 6,5 và 9,5 phút.
Giới hạn phỏt hiện (LOD) 0,1 àg/ml, giới hạn định lƣợng (LOQ) 0,4 àg/ml trong huyết tương và huyết thanh. Độ đúng trong ngày không vượt quá 3,5%; 3,2% đối
với huyết tương, huyết thanh. Độ đúng trong khác ngày không vượt quá 4,7%; 3,1%
đối với huyết tương, huyết thanh. Độ thu hồi trong huyết tương và huyết thanh lần lƣợt là 98,9% và 98,7%.
Shuuji Hara [17] định lượng đồng thời PQ và DQ trong huyết tương bằng phương pháp HPLC. Hệ sử dụng bơm L-7120 (Hitachi, Tokyo, Nhật), van bơm mẫu (20 àl) Rheodyne 7125. PQ, DQ, IS đƣợc tỏch trờn cột pha đảo Capcell PaK C18 UG120 (150-4,6 mm, cỡ hạt 5àm, của Shiseido Co., Tokyo, Nhật) bằng dung dịch rửa giải của methanol và 200 mM axit phosphoric với diethyl amine 0,1M và sodium 1-heptane sulphonate 12 mM (1:4, v/v). Tốc độ dòng của pha động 0,5 ml/phút và nhiệt độ cột trong khoảng từ 15-20oC. Dịch rửa từ cột HPLC đƣợc trộn với dung dịch kiềm của Sodium hydrosulfite bằng thiết bị trộn. Tốc độ dòng 0,4 ml/phút. Hỗn hợp đƣợc dẫn vào sợi dây (1 m x 0,5 mm) và đƣợc làm ấm trong bể nước SB-9 (EYELA, Tokyo, Nhật) ở nhiệt độ 20oC và đo ở bước sóng 391 nm bằng detector UV Hitachi L- 7405. Độ cao của pic đƣợc dùng để định lƣợng bằng máy C- R6A Chromatopak (Shimadzu, Kyoto, Nhật). Giới hạn phát hiện của PQ và DQ là 50 và 100 ng (0,19 và 0,29 nmol) trên ml huyết tương.
Định lượng PQ trong huyết tương sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo cặp ion đã đƣợc Brunetto M.R. thực hiện trên hệ thống sắc ký đƣợc sử dụng có 2 bơm, 1 bơm 2 nòng để chuyển pha động vào cột phân tích và bơm Knauer Model 64 để chuyển pha động vào cột chiết. Van tiêm (V1) 6 cửa có các vòng mẫu 20, 100 hoặc 200 àl để đƣa mẫu vào cột chiết. Sử dụng cỏc cột 25 - 4 mm đƣợc lấp đầy cỏc hạt LiChrospher RP-18 ADS (kớch thước hạt 25 àm) và cột VARIAN ODS C-18 (25 cm ì 4,6 mm, hạt 5 àm) lần lƣợt là cột chiết và cột phõn tớch. Cột chiết và cột phân tích đƣợc gắn với van xoay 6 cửa Rheodyne đƣợc điều khiển bằng bơm 2 nòng. Sử dụng detector UV-DAD Perkin-Elmer LC 235 ở bước sóng 258 nm với flowcell 12 àm để phỏt hiện cỏc tớn hiệu.
Các pha động:
- Pha động để chiết (Pha động 1): chứa natri octane sulfonate (SOS) 10mM và acid orthophosphoric 0,05 M được pha bằng nước cất 2 lần, và lọc màng 0,45 àm. Điều chỉnh pH đến 2,8 bằng TEA và thờm 2-propanol nồng độ 3% (v/v).
- Pha động để phân tích (Pha động 2): methanol 40 % và SOS 10 mM trong acid orthophosphoric 0,05 M. Điều chỉnh đến pH 2,8 bằng TEA.
Cỏc dung dịch và pha động đƣợc lọc màng 0,45 àm và loại khớ trong bể siờu âm trước khi sử dụng. Giới hạn phát hiện, tỉ lệ tín hiệu (Signal) / Nhiễu đường nền (Noise) với S/N > 3, là 0,005 àg/ml PQ với thể tớch tiờm mẫu 200 àg [9].
Chen Lu và cộng sự [25] đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để xác định PQ trong huyết thanh người. Trong thí nghiệm này, các mẫu huyết thanh đã đƣợc kết tủa protein lần lƣợt 30% acid perchloric, acetonitrile và dichlormethane, thu đƣợc 50 ml dung dịch. Pha động acetonitrile-đệm (10:90), dung dịch đệm chứa natri heptanesulfonate 0,02 M và acid phosphoric 0,26 M, điều chỉnh pH đến 2,0 bằng triethylamine. Tốc độ dòng 1,2 ml/phút, bước sóng phát hiện 256 nm, nhiệt độ cột 40oC. Đường chuẩn tuyến tính với nồng độ PQ huyết thanh từ 0,1 - 40 mg/l (r = 0,9999). Giới hạn phát hiện là 0,1 mg/l (S/N = 3). Độ lệch chuẩn (RSD) của các mẫu chƣ́ ng nồng độ thấp, trung bình và cao là trong vòng 3,061% - 6,149%, độ lê ̣ch chuẩn gi ữa các lô 0,705% - 2,796%, và đô ̣ thu hồi của phương pháp xử lý
mẫu 96,79 % - 100,07%, và đô ̣ thu h ồi phương pháp là 91,66% - 108,49%. Phương pháp này là đơn giản, nhạy cảm, chính xác, nhanh chóng và cũng chỉ ra rằng có thể đƣợc sử dụng trong chẩn đoán lâm sàng.
* Ngoài ra , một vài phương pháp khác cũng đã đư ợc nghiên cứu để định lươ ̣ng PQ trong máu như: miễn di ̣ch phóng xa ̣ [14], điê ̣n di mao quản [38]…