Đối với các phương pháp sắc ký, nền mẫu và quy trình xử lý mẫu có ảnh hưởng lớn đến kết quả của phương pháp, đặc biệt là với các đối tượng mẫu phức tạp như dịch sinh học. Do đó, để tiến hành định lượng PQ trong huyết tương bằng HPLC có kết quả tốt cần xây dựng một quy trình xử lý phù hợp.
Sau khi tham khảo một số tài liệu [7][17][24][30] và dựa vào các điều kiện hiện có, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nồng độ dung dịch TCA, thời gian lắc xoáy.
3.2.1. Khảo sát nồng độ dung dịch TCA
Trong nghiên cƣ́ u này, chúng tôi nghiên cứu xác định nồng độ PQ trong mẫu huyết tương, là dung dịch mẫu có nền phức tạp và khó đoán định . Trong đó chủ yếu là các loại protein. Để viê ̣c đi ̣nh lượng PQ có kết quả tốt và bảo vê ̣ cô ̣t sắc ký và kéo dài tuổi thọ của cột cần phải loại protein ra khỏi nền mẫu . Qua tham khảo mô ̣t số tài liê ̣u cho thấy a cid trichoroacetic (TCA) là chất thường được sử dụng để kết tủa protein trong các di ̣ch sinh ho ̣c. Vì vậy, chúng tôi sử dụng TCA để loại protein trong nghiên cứu này . Tuy nhiên, nồng đô ̣ TCA ảnh hưởng rất lớn tới quá trình tách và
làm sạch dung dịch mẫu . Do đó cần khảo sát để cho ̣n điều kiê ̣n tối ƣu nồng đô ̣ TCA trong quá trình xƣ̉ lý mẫu.
Trong thí nghiê ̣m này , chúng tôi lựa chọn nồng độ TCA trong khoảng 2,0%
v/v tớ i 6,0% v/v. Quy trình xử lý mẫu sau : Lấy 1,00 ml mẫu huyết tương đã thêm chṍt chuõ̉n PQ với nụ̀ng đụ ̣ 5,00 àg/ml sau đó cho 1 ml TCA với các nụ̀ ng đụ ̣ khác nhau. Hỗn hợp đươ ̣c đem lắc xoáy trong 1 phút, sau đó đem ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút. Dung dịch phía trên được lo ̣c và đem đi phân tích . Kết quả xác đ ịnh lại nồng độ PQ trong mẫu thêm chuẩn bằng phương pháp đường chuẩn thu được trong bảng 3.12
Bảng 3.12: Ảnh hưởng của nồng độ TCA đến hiệu quả chiết PQ ra khỏi huyết tương Nồng đô ̣ TCA
(%)
Nồng đô ̣ PQ
(àg/ml) Độ thu hồi (%) RSD (%)
2,0 4,89 97,8 2,20
4,0 4,93 98,6 1,40
5,0 4,99 99,8 0,20
6,0 4,99 99,8 0,20
Với 1 ml nồng độ dung dịch acid trichloroacetic 5,0 % qua khảo sát đã loa ̣i bỏ được hết protein trong huyết tương , dư lươ ̣ng trong mẫu nhỏ , ít ảnh hưởng đến đường nền nhất và ít pha loãng mẫu.
3.2.2. Khảo sát thời gian lắc xoáy
Thời gian lắc xoay cũng ảnh hưởng tới quá trình tách các chất nền ra khỏi mẫu. Do đó cần phải cho ̣n thời gian lắc xoáy tối ưu để kết quả được tốt nhất .
Quy trình xử lý mẫu sau: Lấy 1ml mẫu huyết tương đã thêm chất chuẩn PQ với nụ̀ng đụ ̣ 5,00 àg/ml sau đó cho 1 ml dung di ̣ch TCA nụ̀ng đụ ̣ 5 %. Hụ̃n hợp được đem lắc xoáy trong 0,5; 1; 2 phút, sau đó đem ly tâm 4000 vòng/phút trong 15 phút. Dung dịch phía trên được lọc và đem đi phân tích. Kết quả thu được trong bảng 3.13:
Bảng 3.13: Ảnh hưởng của thời gian lắc xoay đến quá trình chiết Thời gian lắc xoáy
(phút)
Nồng đô ̣ PQ (àg/ml)
Độ thu hồi (%) RSD (%)
0,5 4,91 98,2 1,8
1,0 4,99 99,8 0,2
2,0 4,99 99,8 0,2
Thời gian lắc xoáy sau khi khảo sát ở các thời gian 30 giây; 1,0 phút và 1,5 phút thì chúng tôi chọn thời gian là 1 phút. Vì khi tiến hành thí nghiệm với thời gian 30 giây độ thu hồi của PQ thấp hơn, còn ở 1 và 1,5 phút không có sự khác biệt.
Như vậy, quy trình xử lý mẫu PQ huyết tương được tiến hành như trong hình 3.14:
Hình 3.14: Sơ đồ quy trình xử lý PQ trong mẫu huyết tương
Dịch lọc Chạy sắc ký
1 ml huyết tương
Hỗn dịch
Dung dịch trong
+ Ly tâm 15 phút (4000 vòng/phút) + Lấy dịch trong phía trên
+ 1 mL TCA 5 %
+ Lọc qua màng cellulose acetate 0,2 àm Lắc xoáy 1 phút
Hình 3.15: Sắc ký đồ PQ trong huyết tương chuẩn áp du ̣ng quy trình xử lý mẫu hình 3.14
3.2.3 Khảo sát độ ổn định mẫu phân tích
Chuẩn bị 3 mẫu nhƣ trên, lấy 1 phần mẫu ra xử lý ngay, phần còn lại bảo quản ở -20oC trong 21 ngày. Lấy các mẫu đang bảo quản ra xử lý và tiến hành sắc ký trong các ngày thứ 7, 14 và 21.
Bảng 3.14: Kết quả xác đi ̣nh đô ̣ ổn đi ̣nh khác ngày Ngày
Mẫu
0 7 14 21
RSD (%)
1 2,00 1,98 1,96 1,95 1,06
2 2,01 1,98 1,97 1,95 1,11
3 2,01 1,97 1,97 1,95 1,11
Nhận xét thấy, các giá trị RSD nhỏ (< 2%) chứng tỏ phương pháp này có độ tái lặp tương đối tốt và giá tr ị sử dụng cao, có thể ứng dụng để phân tích mẫu sau nhiều ngày kể tƣ̀ khi lấy mẫu.