3.3. Xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp
3.3.2. Đánh giá độ lặp lại và tái lặp lại
Với một hệ máy có độ nhạy cao thì sự ổn định và lặp lại đóng vai trò quan trọng trong phân tích. Lặp lại tốt mới có thể cho độ chính xác tốt, trong một phạm vi cho phép. Đối với hệ máy sắc ký, khi đã lựa chọn đƣợc điều kiện tối ƣu cho quá trình tách, thì một yếu tố quan trọng quyết định hiệu quả phân tích đó là độ lặp của thiết bị, bao gồm cả độ lặp diện tích pic và thời gian lưu. Bảng 3.16 chỉ ra độ lặp lại
của hệ sắc ký đã chọn về diện tích pic và thời gian lưu. Quá trình khảo sát được thực hiện trong điều kiện cố định nhƣ sau:
- Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút
- Detector UV-VIS: bước sóng 259 nm
- Hệ dung môi pha động: ACN – dung dịch đê ̣m chứa 1,1mg/ml natri heptanesulfonate; 2 mg/ml KCl; 0,2 %v/v PEG; 0,05% triethyamine điều chỉnh pH = 2,5 bằng H3PO4.
- Chế độ pha động đẳng dòng ACN - Đê ̣m: 5 - 95 %v/v - Thể tớch mẫu tiờm: 30 àl
Mỗi dung dịch đƣợc bơm 5 lần vào cột để xác định độ lặp diện tích pic và thời gian lưu. Kết quả được biểu diễn trên bảng 3.18:
Bảng 3.18: Độ lặp lại thời gian lưu và diện tích pic của các chất
Lần
1,00 àg/ml 5,00 àg/ml 10,00 àg/ml
Diê ̣n tích pic (mAU)
Thời gian lưu (phút)
Diê ̣n tích pic (mAU)
Thời gian lưu (phút)
Diê ̣n tích pic (mAU)
Thời gian lưu (phút)
1 200,95 11,87 1023,57 11,85 2058,56 11,99
2 198,34 11,98 1025,05 11,94 2061,04 12,00
3 205,88 11,94 1026,18 11,86 2062,44 11,94
4 201,52 11,89 1025,97 11,81 2049,53 12,02
5 209,69 11,96 1033,30 12,02 2053,04 12,01
Trung
bình 203,28 11,93 1026,81 11,90 2056,92 11,99
RSD
(%) 2,21 0,39 0,37 0,70 0,27 0,25
Kết quả cho thấy các giá trị RSD < 3% chứng tỏ điều kiện và hệ thống sắc ký HPLC đã lựa chọn là ổn định, phù hợp để định lƣợng PQ.
3.3.2.2. Đánh giá độ chụm (độ lệch chuẩn lặp lại và tái lặp) của phương pháp phân tích
Để xác nhận giá trị sử dụng của phương pháp phân tích, chúng tôi tiến hành đánh giá độ chụm, độ lệch chuẩn lặp lại và tái lặp. Thông thường, quá trình đánh giá đƣợc thực hiện trên các thiết bị khác nhau hoặc cho các kỹ thuật viên khác nhau cùng thực hiện một phép thử nghiệm. Trong điều kiện phòng thí nghiệm, chúng tôi lựa chọn phương pháp đổi kỹ thuật viên.
Mẫu huyờ́t tương đư ợc thờm chuẩn 2 àg/ml. Mẫu được xử lý như mục 3.3.4 và phân tích trên hệ thống HPLC. Quá trình phân tích đƣợc thực hiện song song với mẫu không thêm chuẩn. Từ đó, xác định đƣợc nồng độ PQ thêm vào dựa trên phương trình đường chuẩn. Mỗi kỹ thuật viên làm lặp lại 10 lần. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.19:
Bảng 3.19: Kết quả hàm lượng PQ tìm lại được bằng phương pháp thêm chuẩn của 3 kỹ thuật viên khác nhau
STT KTV-1(àg/ml) KTV-2 (àg/ml) KTV-3 (àg/ml)
1 1,99 1,99 2,01
2 2,00 1,99 2,00
3 2,00 1,97 2,00
4 2,00 1,97 1,97
5 1,99 1,98 1,98
6 2,00 2,02 1,98
7 2,00 1,98 2,00
8 1,98 1,98 2,01
9 1,98 2,00 2,00
10 2,00 2,01 2,00
Từ các kết quả trên, sử dụng phần mềm minitab 16, chúng tôi thu đƣợc bảng dữ kiện thống kê nhƣ bảng 3.20.
Bảng 3.20: Các dữ kiện thống kê đánh giá độ lặp lại của phương pháp phân tích tiến hành bởi ba KTV khác nhau
Đại lƣợng đánh giá KTV-1 KTV-2 KTV-3
Xtb 1,99 1,98 1,99
Độ lệch chuẩn lặp lại (SD) 0,01 0,02 0,01
Độ lệch chuẩn lặp lại tương đối (% RSD) 0,45 0,75 0,65 Sai số tương đối (ER) (%)
(so với giá trị trong mẫu chuẩn) -0,35 -0,55 -0,20
Phương sai 0,000081 0,000225 0,000169
Nhƣ vậy, căn cứ vào các giá trị % RSD của mỗi KTV có thể kết luận, đối với phép định lƣợng PQ, độ chụm (hay độ lặp lại) của KTV-1 là tốt nhất và của KTV-2 là kém nhất. Tuy nhiên, các giá trị RSD là nhỏ (< 1%) chứng tỏ cả ba KTV làm thí nghiệm đều cho độ chụm (độ lặp lại) tốt.
Dựa vào sai số tương đối giữa giá trị trung bình tìm được và giá trị đúng μ có thể kết luận kết quả phân tích của cả ba KTV đều mắc sai số hệ thống âm. Độ đúng đánh giá qua sai số tương đối cho thấy kết quả phân tích PQ của KTV-3 là tốt nhất và KTV-2 là kém nhất. Tuy nhiên, cả ba giá trị sai số tương đối đều thấp (<
1%), chứng tỏ các KTV đều làm đúng. Nói cách khác, kết quả phân tích của cả ba KTV đều chính xác (độ chụm tốt, độ đúng cao).
Từ các kết quả trên bảng 3.20, chúng tôi tiếp tục tính toán độ lệch chuẩn tái lặp của PTN theo các công thức:
- Phương sai trong cùng mẫu (within-sample estimation of variance):
S2r =
k S MS
k
j i within
1
2
- Trung bình tập hợp là
k x x
k
j
i
1
- Phương sai giữa các mẫu (between-sample estimation of variance):
1 ) (
1
2
k
x x k MS
k
j j between
- Phương sai tái lặp
S2R= S2L + S2r = MSwithin + MSbetween - Độ lệch chuẩn tái lặp tương đối
%RSDR = 100.SR/x (%)
- Dùng các công thức trên, chúng tôi thu đƣợc các kết quả nhƣ bảng 3.21.
Bảng 3.21: Các dữ kiện đánh giá độ tái lặp của phương pháp phân tích
Đại lƣợng PQ
Phương sai trong cùng mẫu MSwithin 0,000158
Trung bình tập hợp 1,99
Phương sai giữa các mẫu MSbetween 0,000037
Phương sai tái lặp 0,000195
Độ lệch chuẩn tái lặp tương đối
(% RSDR) 0,70
Nhận xét thấy, các giá trị RSDR nhỏ (< 1%) chứng tỏ phương pháp này có độ tái lặp tốt và giá trị sử dụng cao, có thể ứng dụng để phân tích ở nhiều phòng thí nghiệm khác nhau.