1.2. Tổng quan về vi khuẩn lactic
1.2.3. Khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic
Khả năng đối kháng của các vi khuẩn lactic liên quan đến sự ức chế của các vi sinh vật khác, được gây ra bởi sự cạnh tranh các chất dinh dưỡng và sự sản xuất ra các chất kháng sinh (Holzapfel, 1995). Khả năng kháng nấm và các thành phần ức chế đã được tìm thấy và công nhận trong nhiều nghiên cứu.
Các vi khuẩn lactic (LAB) có thể sản xuất một số chất kháng sinh như acid lactic và reuterin, ngoài ra còn có các acid hữu cơ, peroxit hydro, bacteriocin kháng khuẩn và các loại peptide kháng nấm. LAB đã được biết đến trong nhiều năm và đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất của một loạt các thực phẩm lên men.
Lợi ích sức khỏe của LAB được biết là ảnh hưởng tích cực nhất định trong đường tiêu hóa của con người (Cogan và cộng sự năm 1995, Hafidh và cộng sự, 2010).
Giống Lactobacillus đã được báo cáo là có hoạt tính kháng nấm khi đánh giá bằng khảo nghiệm thạch lớp phủ chống lại loạt các nấm hư hỏng. Hoạt động kháng nấm của L.coryniformis cornyformis subsp ổn định khi bị nung nóng ở nhiệt độ cao và độ pH 3-4,5 (Magnusson và Schnurer, 2001).
Hầu hết các nghiên cứu khả năng kháng nấm của LAB là do việc sản xuất một loại protein kháng nấm hoặc hợp chất proteinaceous và một số các LAB như L.Plantarum và L.Sanfrancisco đặc biệt sản xuất acid hữu cơ với các đặc tính kháng nấm (Corsetti và cộng sự năm 1998; Lavermicocca và cộng sự, 2003.). Hiện nay, hợp chất bảo quản sinh học (biopreservative) duy nhất - nisin có thể được thêm vào
19
thực phẩm sản phẩm của vi khuẩn acid lactic (Gardiner và cộng sự, 2000; Corcoran và cộng sự, 2004.).
Nghiên cứu về tiềm năng kháng nấm của LAB đã xác định được một số hợp chất có tác dụng ức chế chống lại nấm mốc và các loài nấm men khác nhau (Corsetti và cộng sự, 1998, (Bảng 1.2).; Lavermicocca và cộng sự, 2000;.Niku- Paavola và cộng sự, 1999; Magnusson, 2003; Sjogren và cộng sự, 2003.Sjogren, 2005).
Bảng 1.2. Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men (Corsetti và cộng sự, 1998)
Hợp chất được xác định Nguồn sản xuất giống
4-hydroxy-phenyllacticacid 3-phenyllacticacid Lactobacillusplantar 21B 3 -hydroxydecanoicacid 3 -hydroxydodecanoicacid 3
-hydroxytetradecanoicacid 3-hydroxy-5-cis – dodecenoicacid
Lactobacillusplantarum MILAB14
cyclo(Gly-Leu) methylhydantoin mevalonolactone
Lactobacillusplantarum VTTE-78076
Caproic-, propionic-, buturic-, acetic-, formic- and n- valeric acid.
Lactibacillus
sanfranciscensis CB1
Roy và cộng sự báo cáo đã phân lập được 2100 khuẩn lạc lactic từ phô mai cũ và sữa trâu sống, đã cho thấy hoạt tính kháng nấm chống lại Aspergillus flavus IARI và phân lập nhiều nhất vi khuẩn Lactococcus subsp CHD-28.3 có hoạt tính kháng nấm chống lại Aspergillus flavus IARI, A.flavus NCIM 555, A.parasiticus NCIM 898 và Fusarium sp.. Nấm Aspergillus IARI được xem là chất cảm ứng cho chủng lactic này (Roy và cộng sự, 1996)
Chi Lactobacillus thường được phân lập và nghiên cứu nhiều nhất. Các chủng kháng nấm được phân lập từ các sản phẩm khác nhau như bột nhào chua (Corsetti
20
và cộng sự, 1996), xúc xích (Coloretti và cộng sự, 2007), thức ăn ủ chua (Magnusson và Schnurer, 2001), phô mai và sữa (Roy và cộng sự, 1996) và rau (Sathe và cộng sự, 2007).
21
Bảng 1.3. Phân lập vi khuẩn lactic với khả năng ức chế độc tố sinh trưởng của nấm mốc và nấm men
Corsetti và cộng sự báo cáo về tác dụng ức chế nấm của LAB khác được phân lập từ bột nhào chua là Lactobacillus sanfranciscensis CB1 (Corsetti và cộng sự , 1998). Họ phát hiện ra một hỗn hợp của acid hữu cơ là bổ trợ về tác dụng ức chế
22
của dòng này (acetic , caproic , formic , propionic, butyric và acid n- valeric), trong đó acid caproic dường như quan trọng nhất. Tất cả các chất này được xác định là những hợp chất có phân tử lượng thấp, nhưng cũng có những báo cáo của các hợp chất protein không xác định với hoạt động kháng nấm rộng (Gourama và Bullerman ,1997; Magnusson và Schnürer , 2001). Một peptide giống như bacteriocin có hiệu lực kìm nấm Candida albicans đã được báo cáo bởi Okkers và cộng sự.(Okkers và cộng sự , 1999).
Vi khuẩn lactic có khả năng sản xuất một lượng lớn các sản phẩm có tính axit và các hợp tố khác với hoạt tính kháng nấm mạnh. Đa số các chất kháng nấm được xác định đều có trọng lượng phân tử thấp bao gồm acid hữu cơ, H2O2, hợp chất proteinaceous, acid béo hydroxyl,… (Bảng 1.4)
Bảng 1.4. Các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic có tính kháng sinh.
(Holzapfel và cộng sự, 1995)
Sản phẩm Các sinh vật chính
Axit hữu cơ
-Axit lactic Vi khuẩn gram âm, 1 vài loài nấm -Axit acetic Nấm men, nấm, vi khuẩn gây thối rửa
H2O2 Sinh vật gây bệnh, đặc biệt trong thức ăn giàu protein
Enzyme
-hệ thống lactoperoxidase với H2O2
-Vi khuẩn gây bệnh (sữa và các sản phẩm làm từ sữa)
23
Ngoài sự ức chế tăng trưởng thực tế của nấm, LAB cũng có thể ức chế sản phẩm đặc biệt của độc tố nấm mốc (Gourama và Bullerman, 1997) hoặc làm bất động độc tố thông qua liên kết với bề mặt của chúng (El-Nezami và cộng sự, 2004).
Các hợp chất kháng nấm và phương thức hoạt động
Chất ức chế tăng trưởng nấm có tầm quan trọng cả trong việc kiểm soát tác nhân gây bệnh của con người và động vật, và trong công tác phòng chống nấm mọc trong thực phẩm và các vật liệu khác. Các phương thức hoạt động của kháng sinh chống nấm hiện nay là rất quan trọng cho sự ức chế nấm. Nhiều chất trong số các chất này được dành riêng cho sử dụng lâm sàng nhưng một số đang được sử dụng trong sự kiểm soát của nấm gây bệnh thực vật. Thuốc kháng sinh được xác định là chất được sản xuất bởi các vi sinh vật có tác dụng diệt hoặc ức chế sự phát triển của vi sinh vật khác ở nồng độ thấp.
-lysozyme Vi khuẩn gram dương
Reuterin(3-OH- propionaldehyde)
Nấm mốc, nấm men
Diacetyl Vi khuẩn gram âm
Axit béo Các loại vi khuẩn khác nhau
Bacteriosin
-nisin 1 vài loại vi khuẩn lactic, vi khuẩn gram dương, các thể nội bào tử
-1 số loại khác Vi khuẩn gram dương
24
Phương pháp khảo sát khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic
Để phân lập tuyển chọn được các vi khuẩn nói chung và vi khuẩn lactic nói riêng có khả năng kháng nấm, tiến trình thí nghiệm được trình bày trên hình 1.2.
Bước 1: đầu tiên vi khuẩn lactic được nuôi cấy trong môi trường lỏng và canh trường (bao gồm cả tế bào) được sử dụng để khảo sát khả năng ức chế tăng trưởng nấm mốc bằng phương pháp nuôi cấy trên đĩa thạch. Nếu kết quả dương tính, người ta bắt đầu tìm hiểu khả năng kháng nấm của các sản phẩm trao đổi chất tế bào.
Bước 2: dịch nuôi cấy sau ly tâm loại bỏ tế bào được sử dụng để khảo sát khả năng ức chế nấm mốc trên đĩa thạch. Nếu kết quả dương tính có thể tiến hành trích ly các hợp chất kháng nấm theo bước 3.
Bước 3: các hợp chất kháng nấm có thể là enzyme (protease, beta-glucanase, chitinase, cellulase) hoặc các hợp chất hữu cơ phân tử nhỏ khác. Trích ly các hợp chất này bằng phương pháp thích hợp và thử hoạt tính các phân đoạn riêng biệt.Trường hợp có một số phân đoạn dương tính, tiến hành tiếp bước 4.
Bước 4: là bước tinh sạch từng phân đoạn, xác định cấu trúc phân tử và khối lượng phân tử, cũng như độ tinh sạch bằng một số phương pháp phân tích như sắc ký bản mỏng (TLC), sắc ký lỏng cao áp (HPLC), khối phổ (MS), cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) và khẳng định khả năng kháng nấm của hợp chất tinh sạch.
Như vậy trong suốt sơ đồ thí nghiệm, phương pháp được áp dụng là định tính khả năng kháng nấm theo một trong những phương pháp sau:
Phương pháp đối kháng trực tiếp (đối kháng che phủ): phương pháp che phủ như mô tả của Magnusson và Schnurer (2001). LAB được cấy thành hai dòng 2 cm trên đĩa thạch MRS và ủ kị khí ở 370C trong 24 giờ. Sau đó chúng được phủ lên bằng 10ml chiết xuất malt thạch mềm có chứa 105 bào tử/ml nấm và ủ hiếu khí ở 300C trong 48 giờ. Sau 48 giờ nuôi cấy, vùng ức chế sẽ được đo.
Phương pháp này về kỹ thuật khó thực hiện vì phải dùng hai môi trường.
25
Phương pháp sử dụng sản phẩm trao đổi chất vi khuẩn đối kháng nấm mốc (phương pháp đục lỗ thạch): LAB được cấy vào môi trường MRS và ủ ở 370C trong 24 giờ. Dịch sau ly tâm của LAB thu được sau khi tiến hành ly tâm sẽ được lọc qua màng lọc vô trùng. Tiến hành đục lỗ thạch trong môi trường thạch MRS, đường kính lỗ thạch là 5mm. Thêm 60ml dịch nuôi cấy sau ly tâm của LAB vào lỗ thạch. Sau đó, phần nhỏ của sợi nấm 5 ngày tuổi được nuôi trong môi trường PDA sẽ được đặt trong lỗ thạch có chứa dịch LAB sau ly tâm.
Các đĩa thạch được ủ ở 300C trong 24, 48 và 72 giờ. Hoạt động ức chế được xác định bằng đường kính của các sợi nấm.
26
TLC HPLC
MS NMR
Hoạt chất kháng nấm
Khảo sát đối kháng với nấm Khảo sát đối kháng
với nấm
Trích ly bằng dung môi thu các phân
đoạn
Khảo sát đối kháng với nấm
Xácđịnh hoạt chất trong từng phân đoạn Canh trường nuôi cấy
LAB (lỏng)
Dịch trong sau ly tâm
Khảo sát đối kháng với nấm
Hình 1.2. Sơ đồ tổng quát nghiên cứu khả năng kháng nấm của vi khuẩn nói chung và vi khuẩn lactic nói riêng
27