Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.6. Phương pháp nghiên cứu
2.6.5. Một số phương pháp khảo sát hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hoá
2.6.5.1. Nhuộm Gram
- Mục đích: Dựa vào cấu trúc vách tế bào giúp ta xác định nhóm của vi khuẩn là vi khuẩn Gram dương (Gram – positive) hay vi khuẩn Gram âm (Gram – negative). Ngoài ra nhuộm Gram cho phép ta quan sát rõ hình thái tế bào hơn so với soi vi khuẩn sống.
- Tiến hành: Sử dụng phương pháp Hucker cải tiến. Vi khuẩn đem nhuộm gram phải là vi khuẩn mới cấy truyền sau 24 giờ. Ngược lại vi khuẩn già cho kết quả sai lệch.
- Kết quả: vi khuẩn Gram dương bắt màu tím, vi khuẩn Gram âm bắt màu hồng 2.6.5.2. Nhuộm bào tử
- Mục đích: Dựa trên cấu trúc đặc biệt của màng bào tử: dày, chắc, khó bắt màu, chứa nhiều lipid. Trước hết xử lý để tế bào chất dễ bắt màu bằng nhiệt và acid.
Nhuộm màu cả tế bào chất của bào tử và tế bào bằng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh. Tẩy màu tế bào chất của tế bào và nhuộm nó bằng thuốc nhuộm khác bổ sung. Nhờ đó tế bào chất của bào tử và tế bào chất bắt màu phân biệt. Theo sơ đồ Bergey thì chủng LAB không sinh bào tử. Do đó việc xác định này nhằm loại bỏ các vi khuẩn sinh bào tử như Bacillus sp. và Clostridium spp.
- Tiến hành: Dùng phương pháp Schaeffer – Fulton.
- Kết quả: Bào tử có màu lục, tế bào có màu đỏ 2.6.5.3. Thử nghiệm khả năng lên men đường
- Mục đích : Kiểm tra vi sinh vật có khả năng lên men các loại đường nào.
- Tiến hành : Môi trường MRS broth với lượng đường glucose lần lượt thay thế bằng các loại đường cần kiểm tra. Phân môi trường vào các ống nghiệm, mỗi ống 10ml. Đặt vào mỗi ống nghiệm 1 ống nhỏ (ống Durham) lộn ngược đầu để hứng khí CO2 sinh ra nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường. Khử trùng trong
38
15 phút ở 1210C.
Cấy vi khuẩn mới hoạt hóa vào các ống nghiệm, đặt ở 370C, theo dõi hiện tượng sinh acid sau 1-3 ngày. Có trường hợp cần dùng paraffin để bịt kín nút bông và theo dõi trong 14-30 ngày.
- Kết quả: Nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường (sinh acid) chất chỉ thị BPB (Bromophenol Blue) sẽ chuyển sang màu vàng.
2.6.5.4. Thử nghiệm khả năng sinh acid lactic
- Mục đích: Kiểm tra khả năng sinh acid lactic của vi khuẩn trong quá trình trao đổi chất của chúng.
- Tiến hành: Sử dụng thuốc thử Uffelmann: 10 giọt dung dịch phenol và 1 giọt FeCl3 1% thu được dung dịch màu tím. Nhỏ vài giọt dung dịch thuốc thử Uffelmann có màu tím lên khuẩn lạc trên đĩa thạch. Nếu có acid lactic, dung dịch sẽ chuyển sang màu vàng nhạt. Mẫu đối chứng là vi khuẩn Bacillus sp.
2.6.5.5. Xác định hàm lượng acid tổng
- Mục đích: Xác định hàm lượng acid tồng bằng phương pháp quy về acid lactic để xác định hàm lượng acid lactic sinh ra từ các chủng vi khuẩn lactic thử nghiệm nhằm chọn ra chủng vi khuẩn lactic mạnh nhất để kháng nấm. Hàm lượng acid trong dịch lên men có thể định lượng bằng dung dịch kiềm chuẩn nhờ có sự đổi màu của dung dịch thuốc thử Phenolphatalein.
- Tiến hành: Định lượng acid lactic bằng dung dịch NaOH 0,1N với chất chỉ thị Phenolphtalein 1% : Cho vào bình tam giác 10ml dịch lên men vi khuẩn, thêm 2 giọt Phenolphtalein và chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt. Sử dụng máy đo pH để chuẩn độ đến khi pH đạt 8,6 và ghi nhận kết quả.
- Kết quả: Hàm lượng acid tổng được quy về acid lactic theo công thức:
% 𝑎𝑐𝑖𝑑 𝑙𝑎𝑐𝑡𝑖𝑐 = 𝑉𝑁𝑎𝑂𝐻 × 0.1 × 90 × 100 1000 × 10
39
Trong đó:
VNaOH: Thể tích NaOH 0.1 N chuẩn độ được 10: Số ml dịch Dx được đem đi chuẩn độ 0.1: Nồng độ NaOH dùng để chuẩn độ 1000: Hệ số chuyển đổi ra gam
90: Mỗi ml NaOH chuẩn độ tương đương với 90 mg acid lactic trong dịch Dx
2.6.5.6. Thử nghiệm protease
- Mục đích: xác định khả năng vi sinh vật tổng hợp được enzyme protease phân huỷ cơ chất casein
- Nguyên tắc: casein có thể được xem là một nguồn carbon và năng lượng cho vi khuẩn. Nhưng vì casein không thể thẩm thấu qua màng tế bào (casein là một loại protein sữa) nên vi khuẩn phải tiết ra enzyme protease, phân huỷ casein thành các amino acid để có thể dễ dàng vận chuyển vào bên trong tế bào. Casein được phối trộn với môi trường dinh dưỡng, tạo cho môi trường có màu trắng đục. Khi thời gian ủ, nếu vi khuẩn có thể tiết ra enzyme protease sẽ tạo ra một vòng phân giải. Nếu không môi trường chung quanh vi khuẩn sẽ vẫn bị đục.
- Tiến hành:
Môi trường sử dụng là môi trường huyền phù casein 1% bổ sung 1.5% agar, được hấp khử trùng ở 1210C trong 30 phút. Được phối vào đĩa petri đã được hấp khử trùng, mỗi đĩa khoảng 15ml. Khi thạch đã đông, tiến hành đục lỗ tạo 3 giếng thạch.
Bơm dịch cần thử nghiệm vào 2 trong 3 giếng thạch (giếng còn lại làm đối chứng). Ủ ở 370C theo dõi từ 24 – 48 giờ. Vi khuẩn được cho là có hoạt tính protease khi môi trường xung quanh giếng thạch tạo thành vòng phân giải.
40
Có thể tráng qua bề mặt thạch bằng dung dịch TCA 5% để phát hiện kết quả rõ ràng hơn.
2.6.5.7. Thử nghiệm chitinase
- Mục đích: Xác định khả năng vi sinh vật tổng hợp được enzyme chitinase phân hủy được cơ chất chitin.
- Nguyên tắc: Chitin được phối trộn vào môi trường dinh dưỡng. Khi vi sinh vật sử dụng enzyme chitinase để phân hủy chitin thành dạng có cấu trúc mạch ngắn hơn là các n-acetyl-D-glucosamine, hợp chất này không có phản ứng màu với lugol. Do đó khi cho thuốc thử lugol, độ lớn của vòng trong suốt không bắt màu lugol.
- Tiến hành:
Môi trường sử dụng là môi trường huyền phù chitin 1% bổ sung 2% agar được hấp khử trùng ở 121oC, 1 atm trong 15 phút. Đã được phối vào đĩa petri đã được hấp khử trùng, mỗi đĩa khoảng 15 ml. Khi thạch đã đông tiến hành đục lỗ tạo 3 giếng thạch.
Bơm dịch cần thử nghiệm vào 2 trong 3 giếng thạch (giếng còn lại làm đối chứng). Ủ ở 37oC ủ trong 48 giờ. Vi khuẩn được cho là có hoạt tính chitinase khi môi trường xung quanh giếng thạch tạo thành vùng sáng không bắt màu thuốc thử lugol.