3.3.1. Thử hoạt tính chống oxy hóa Phương pháp phân tích
Phản ứng được tiến hành theo phương pháp của Shela G., Olga, M. B., Elena, K., và các cộng sự (2003). Dựa trên nguyên tắc 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH) có khả năng tạo ra các gốc tự do bền trong dung dịch EtOH bão hoà. Khi cho các chất thử nghiệm vào hỗn hợp này, nếu chất có khả năng làm trung hoà hoặc bao vây các gốc tự do sẽ làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của các gốc tự do DPPH. Hoạt tính chống ôxy hoá đƣợc đánh giá thông qua giá trị hấp thụ ánh sáng của dịch thí nghiệm so với đối chứng khi đọc trên máy Elisa ở bước sóng 515 nm.
Khả năng bẫy các gốc tự do SC% (Scavenging capacity):
Giá trị trung bình của SC% ở các nồng độ mẫu được đưa vào chương trình xử lý số liệu Exel theo công thức:
OD thí nghiệm - OD mẫu trắng
SC% = [100 - x 100] ± OD chứng âm tính
Độ lệch tiêu chuẩn tính theo công thức của Ducan nhƣ sau:
( xi - x )2
=
n - 1
Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (SC≥50%) sẽ được thử nghiệm bước 2 để tìm giá trị SC50
Mẫu được pha theo 5 thang nồng độ. Giá trị SC50 được xác định bằng chương trình table curve thông qua nồng độ chất thử và % hoạt động của chất thử mà ở đó 50% các gốc tự do tạo bởi DPPH đƣợc trung hoà bởi chất thử.
3.3.2. Thử hoạt tính gây độc tế bào
Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào:
Các dòng tế bào:
Đƣợc cung cấp từ phòng Sinh học Thực nghiệm – Viện Hoá học các Hợp chất Thiên nhiên, gồm:
- Fl: Ung thƣ tử cung
- MCF7: Ung thƣ biểu mô vú - RD: Ung thƣ mô liên kết - HepG2: Ung thư gan người Môi trường nuôi tế bào:
Môi trường nuôi các dòng tế bào ung thư:
- Môi trường MEME (Minineal Essential Medium with Eagle‟s salts) bổ sung 7-10% huyết thanh bê tươi, 1% dịch kháng sinh PSF (potassium penicillin–
streptomycin– fungizone) và 1% NAA (nonessential amino acid).
- Hoặc môi trường DMEM (Dullbecco‟s modified Minimum Essential Medium): 10% huyết thanh bê tươi, 1% dịch kháng sinh (PSF), 1% NAA.
- Dịch kháng sinh PSF: 100 đơn vị penixilin/ml, 100 g streptomyxin sunfat/ml, 0,25 g amphoterixin B/ml.
- Đệm PBS (phosphate bufferred saline, g/L): NaCl 8; KCl 0,2; Na2HPO4 1,15; KH2PO4 0,2; Khử trùng 1 atm trong 30 phút.
Phương pháp
Nuôi tế bào ung thƣ in vitro theo Skehan và CS. Xác định hoạt tính gây độc các dòng tế bào ung thư theo phương pháp SRB của Likhiwitayawuid và các cộng sự (CS) đang đƣợc tiến hành tại Viện Nghiên cứu Ung thƣ Quốc gia của Mỹ (NCI).
Phương pháp này đã được phòng Sinh học Thực nghiệm thuộc Viện Hoá học các Hợp chất Thiên nhiên áp dụng từ năm 1996.
Phép xác định gồm hai bước như sau:
Bước 1: Sàng lọc tìm các mẫu thử có hoạt tính Chuẩn bị tế bào
Dòng tế bào được lưu giữ trong nitơ lỏng, hoạt hóa và duy trì trong các môi trường dinh dưỡng MEME, Eagle hoặc DMEM có bổ sung huyết thanh bê tươi 7- 10%.
Tế bào đƣợc nuôi trong các điều kiện tiêu chuẩn (CO25%; độ ẩm 98%; nhiệt độ 37oC, vô trùng tuyệt đối), tế bào được hoạt hoá trước khi thí nghiệm tiến hành từ 18-24 giờ.
Dùng dung dịch tripsin versel 0,1% để tách tế bào sau khi đã rửa tế bào bằng đệm PBS. Pha tế bào bằng môi trường sạch, đếm số lượng, tạo huyền dịch tế bào ở nồng độ thí nghiệm ( khoảng 3-5x104 tế bào/ml tùy theo từng loại tế bào thử nghiệm).
Chuẩn bị mẫu thử
Hòa tan mẫu thử bằng dung môi DMSO với nồng độ 4 mg/ml đối với chất thô, 2 mg/ml đối với chất tinh.
Tiến hành thí nghiệm
Nhỏ vào các giếng của phiến thí nghiệm theo sơ đồ nhƣ sau:
Dãy đối chứng âm: DMSO 10%
Dãy đối chứng dương: chất chuẩn có khả năng diệt tế bào, elipitine hoặc colchicine, pha tới nồng độ 0,01Mm trong DMSO.
Phiến đƣợc ủ trong tủ CO2 ở 37oC trong 3 ngày.
Kết thúc thí nghiệm
Tế bào sau khi ủ 3 ngày đƣợc cố định bằng dung dịch TCA lạnh. Rửa, để khô, nhuộm SRB 0,4% trong axit axetic 1% và rửa lại bằng axit axetic 1% để loại màu thừa; để khô, hoà lại bằng dung dịch đệm Trisbazơ 10M trên máy lắc ngang.
Đọc trên máy ELISA ở bước sóng 495-515mm.
Chú ý: Luôn phải có phiến đối chứng cho lƣợng tế bào ở thời điểm bắt đầu thí nghiệm (ngày 0). Phiến đối chứng ngày 0 có chứa dịch huyền phù tế bào trong các giếng, để tủ ấm CO2 ở 37oC trong 30 phút. Cách cố định và nhuộm nhƣ trên.
Tính kết quả
Tính giá trị CS % (% Cell Survival)
Giá trị CS: là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ ban đầu của mẫu thử, mẫu nào cho giá trị CS ≤ 50% thì đƣợc đánh giá là có hoạt tính.
Giá trị CS(%) đƣợc tính theo công thức:
Trong đó: OD: mật độ quang σ: độ lệch tiêu chuẩn
σ đƣợc tính theo công thức:
: giá trị OD trung bình
n: số giếng thử lặp lại
Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS50 ≤ 50% ± ) sẽ đƣợc chọn ra cho thử nghiệm bước 2 để tìm giá trị IC50.
Bước 2: Tìm giá trị IC50
Dùng giá trị CS% của 10 nồng độ, dựa vào chương trình Table curve theo thang giá trị logarit của đường cong phát triển tế bào và nồng độ chất thử để tính giá trị IC50.
Công thức:
Trong đó: y: nồng độ chất thử X: Giá trị CS (%)
Cỏc mẫu thụ cú giỏ trị IC50 ≤ 20 àg/ml đƣợc coi là cú hoạt tớnh.