Phần 3. Đối tượng, vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.7. Phương pháp nghiên cứu
3.7.4. Phương pháp nghiên cứu sinh trưởng, phát triển của nấm trên môi trường nuôi cấy và khả năng lây bệnh nhân tạo của nấm B. maydis
3.7.4.1. Chuẩn bị nguồn nấm
Cấy nấm từ ống nghiệm (ống nguồn) vào đĩa petri chứa môi trường PSA (cấy 1 điểm ở chính giữa đĩa) sau 4 - 6 ngày dùng đĩa đó để làm nguồn cấy nấm.
3.7.4.2. Cấy nấm lên các môi trường khác nhau
Từ nguồn nấm thuần đã chuẩn bị làm nguồn cấy ở trên, ta dung đột tròn có đường kính 5 mm đột nấm ở đĩa theo đường tròn đồng tâm sau đó dùng que cấy lấy từng khoanh cấy trên các môi trường đã chuẩn bị (mỗi đĩa cấy 1 khoanh ở chính giữa đĩa petri, mỗi môi trường cấy 3 đĩa.). Đo đường kính của tản nấm sau 2, 3, 4, 5 ngày, đo gián tiếp ở phía ngoài đĩa petri, không mở hộp, đo 2 lần theo chiều vuông góc đĩa qua tâm của đĩa theo hình dấu cộng (+).
a. Cấy nấm lên môi trường PSA để ở các nhiệt độ khác nhau
Đo đường kính của tản nấm sau 3, 5, 7 ngày trong đĩa để tủ định ôn với nhiệt độ từ 10, 20, 30, 40°C.
b. Khả năng nảy mầm của bào tử
Sau khi cấy nấm 7 ngày trên môi trường PSA, rửa sạch sợi nấm trên bề mặt đĩa petri bằng chổi lông vô trùng và nước cất. Để khô sau đó đặt đĩa vào trong tủ để 12 giờ sáng, 12 giờ tối để nấm sinh bào tử. Sau đó dùng 20 ml nước cất có Tween 20 tỷ lệ 1/10.000 để rửa và lọc lấy bào tử cho vào 1 hộp petri, lấy 1 giọt
dung dịch bào tử nhỏ lên lam đậy lamen lại đưa lên kính hiển vi quan sát. Kiểm tra mật độ bằng buồng đếm hồng cầu. Dùng pipet hút 1 ml trang đều trên môi trường WA. Để trong điều kiện phòng thí nghiệm. Đếm tỷ lệ nảy mầm của bào tử nấm:
Mầm dài bằng 2/3 độ dài bào tử thì được tính là nảy mầm (Plant Phytopathology).
- Chỉ tiêu theo dõi: số bào tử nảy mầm sau 0.25 h; 0.5 h; 1.0 h; 1.5 h; 2.0 h và 2.5 h.
- Chỉ tiêu kích thước bào tử nấm: dùng thước đo kính hiển vi quang học, thước có 10 vạch lớn, mỗi vạch lớn có 10 vạch nhỏ như vậy tổng có 100 vạch nhỏ. Đo ở vật kính 10X. Đếm số vạch rồi nhân lên với 10 là ra kích thước cần đo.
3.7.4.3. Thử nghiệm hiệu lực ức chế của thuốc đối với sự phát triển của nấm B. maydis trên môi trường nhân tạo
CT1: Thuốc Daconil 75WP nồng độ 0.01%;
CT2: Thuốc Score 250EC nồng độ 0.01%;
CT 3: Valivithaco 5SL nồng độ 0.01%;
CT4: Đối chứng (dùng nước cất vô trùng).
Cách pha thuốc:
+ Dùng bơm tiêm hút 1 ml thuốc hòa vào 9 ml nước vô trùng được dung dịch A;
+ Lấy 1 ml dung dịch A hòa vào 9 ml nước vô trùng được dung dịch B;
+ Lấy 1 ml dung dịch B hòa và 99 ml môi trường được nồng độ 0,01%.
Lắc cho thuốc hòa đều vào môi trường.
Tiến hành nhắc lại 3 lần với mỗi công thức. Quan sát đường kính tản nấm phát triển ở các công thức khác nhau và đưa ra kết luận.
Chỉ tiêu theo dõi: đo đường kính tản nấm trong 1, 2, 3, 4, 5 ngày sau cấy của các công thức.
Hiệu lực ức chế thuốc trong phòng thí nghiệm được tính theo công thức Abbott:
C - T
HLĐK (%) = --- x 100 C
Trong đó:
C: đường kính tản nấm ở công thức đối chứng ; T: đường kính tản nấm ở công thức có xử lý thuốc.
3.7.4.4. Lây bệnh nhân tạo bệnh đốm lá nhỏ trong nhà lưới Các công thức dùng trong thí nghiệm này là:
CT1: Lây bệnh không sát thương bằng bào tử;
CT2: Lây bệnh không sát thương bằng sợi nấm (ép thạch);
CT3: Lây bệnh không sát thương bằng tàn dư bệnh (ép vết bệnh).
a. Chuẩn bị cây trồng
Sử dụng giống ngô HN88 trồng trên 18 chậu có chứa đất đã được hấp tiệt trùng và lây nhiễm tác nhân gây bệnh ở giai đoạn 5 - 7 lá. Mỗi chậu trồng 5 cây.
Mỗi lá lây 1 điểm. Tổng số lá lây là 30 lá/1 lần nhắc lại.
b. Lây nhiễm bằng bào tử
Lấy nấm từ ống nghiệm lưu giữ nguồn đã phân lập cấy lên đĩa petri chứa môi trường PSA, sau 10 ngày lúc này sợi nấm sẽ mọc kín môi trường.
Lấy đĩa nấm ra dùng bình tia phun nước cất vào, dùng chổi lông quét đi, quét lại nhiều lần trên bề mặt đĩa, dùng bình tia rửa hết sợi nấm, vẩy chổi cho hết nước quét khô mặt thạch (rửa xong luộc chổi trong nước sôi).
Đặt đĩa nấm trong tủ 12 giờ sáng, 12 giờ tối sau 1 ngày để bào tử hình thành. Dùng 20ml nước vô trùng có pha Tween 20 tỷ lệ 1/10.000 để rửa và lọc lấy bào tử cho một đĩa petri. Lấy 1 giọt dung dịch bào tử đã rửa ở trên nhỏ lên lam kính soi dưới kính hiển vi. Đếm số bào tử trên quang trường 10X. Điều chỉnh dung dịch bào tử sao cho có khoảng 30 - 50 bào tử trên quang trường tương đương với 105 bào tử/ml. (đếm 5 quang trường 10X).
Dùng bút dạ dầu đánh dấu điểm lây. Sử dụng bình phun cầm tay loại dung tích 0,5 lít để phun dung dịch lên phần lá ngô đã đánh dấu. Sau đó phun và giữ ẩm liên tục trong 20 giờ (ẩm trên 90%), sau đó đem ngô đặt dưới ánh sáng tán xạ, tưới nước đầy đủ để ngô vẫn tiếp tục phát triển.
c. Lây bệnh bằng ép thạch
Dùng đĩa nấm đã có sợi nấm mọc kín trên môi trường PSA sau khi cấy chuyển nguồn 10 ngày. Cắt miếng thạch khoảng 1mm3 và ép lên mặt trên của lá.
d. Lây nhiễm bằng ép lá
Dùng lá có triệu chứng bệnh đốm lá nhỏ đặc trưng, kiểm tra bào tử trên kính soi nổi. Sau đó dùng vết bệnh áp lên mặt trên của lá ngô. Theo dõi đếm số lá xuất hiện vết bệnh.
e. Đánh giá
Quan sát thời gian (ngày) kể từ khi lây nhiễm tới khi xuất hiện vết bệnh sau 5, 10, 15, 20 ngày lây bệnh.
Tiến hành thí nghiệm và nhắc lại 3 lần. Từ đó nhận xét về khả năng lây bệnh của nấm gây bệnh.
3.7.4.5. Khả năng kháng nhiễm bệnh đốm lá nhỏ ngô của một số giống ngô trong nhà lưới
Thực hiện lây bệnh không sát thương bằng bào tử. Mỗi công thức lây 30 lá.
Các công thức dùng trong thí nghiệm này là:
CT1: Giống LVN255;
CT2: Giống LVN5885;
CT3: Giống HN88;
CT4: Giống LVN4.
Sử dụng giống ngô kháng bệnh đốm lá nhỏ (LVN255, LVN5885) và giống trồng phổ biến tại địa phương (HN88, LVN4) được trồng trong các chậu có chứa đất tiệt trùng. Hai mươi bốn (24) chậu được lây nhiễm tác nhân gây bệnh ở giai đoạn 5 - 7 lá. Mỗi chậu trồng 5 cây. Quan sát cấp bệnh, tỷ lệ bệnh. Đánh giá toàn bộ số lá lây nhiễm.
Áp dụng theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia QCVN 01-56:2011/BNNPTNT về khảo nghiệm giá trị canh tác và sử dụng của giống ngô
Mức độ biểu hiện Điểm
Không bị bệnh 0
Rất nhẹ (1 - 10%) 1
Nhiễm nhẹ (11 - 25%) 2
Nhiễm vừa ( 26 - 50%) 3
Nhiễm nặng (51 - 75%) 4
Nhiễm rất nặng >75%) 5
Chỉ tiêu theo dõi: Cấp bệnh, TLB (%).