Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên sự sinh trưởng và phát triển của thực vật

2.1.9. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái in vitro

2.1.9.2. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên sự sinh trưởng và phát triển của thực vật

 Chất điều hòa sinh trưởng hoạt động với liều lượng rất thấp, ở liều cao chúng trở nên độc, điều này cho phép một vài chất kích thích tố được sử dụng như các chất diệt cỏ dại.

 Các chất điều hòa nội sinh có thể được kiểm soát do cơ chế chuyển hóa của tế bào nên chúng được kiểm soát hoặc đào thải khá nhanh. Trái lại các chất điều hòa tổng hợp tồn tại lâu hơn nhiều nên thường được sử dụng cho các ứng dụng trong thực tế.

 Auxin

Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật được sử dụng rất thường xuyên trong nuôi cấy mô – tế bào thực vật. Auxin kết hợp chặt chẽ với các thành phần dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo, huyền phù tế bào và điều hòa sự phát sinh hình thái, đặc biệt là khi nó được sử dụng phối hợp với các cytokinin. Sự áp dụng loại và nồng độ auxin trong môi trường nuôi cấy phụ thuộc vào:

Kiểu tăng trưởng hoặc phát triển cần nghiên cứu.

Hàm lượng auxin nội sinh của mẫu cấy.

Khả năng tổng hợp auxin tự nhiên của mẫu cấy.

Sự tác động qua lại giữa auxin ngoại sinh và auxin nội sinh.

Hàm lượng auxin tự nhiên trong mẫu cấy phụ thuộc vào trạng thái của cây mẹ: tuổi cây mẹ, thời gian thu mẫu trong năm.

SVTH: Trần Thị Thu Hiền 21 Auxin là hợp chất có nhân indole, có công thức nguyên là C10H9O2N.

Auxin gồm có hai loại là auxin có nguồn gốc nội sinh do thực vật tạo ra (IAA), và auxin tổng hợp do con người tạo ra (IBA; NAA; 2,4-D;…). IAA tổng hợp được sử dụng trong nuôi cấy mô nhưng nó dễ bị biến tính trong môi trường nuôi cấy và nhanh chóng thoái biến ở trong mô. Tuy nhiên những đặc tính này có thể trở nên hữu dụng bởi vì trong cây IAA cùng với cytokinin sau khi cảm ứng sự hình thành mô sẹo sẽ kích thích sự tạo chồi hoặc phôi khi hàm lượng của nó trong mô giảm dần. IAA thường được sử dụng phối hợp với các chất điều hòa sinh trưởng khác để kích thích sự phát sinh hình thái trực tiếp.

Tuy nhiên, tùy theo mục đích thí nghiệm mà người ta có thể sử dụng các hợp chất giống auxin khác được tổng hợp và nó có những hoạt động hơi khác với auxin như: IBA, 2,4 – D, NAA. 2,4 – D thường được sử dụng phối hợp với cytokinin để cảm ứng sự tạo mô sẹo và huyền phù tế bào và nó sẽ được thay thế bởi IBA hay NAA để kích thích sự phát sinh hình thái. IBA và NAA là loại auxin thích hợp trong nuôi cấy chồi. IAA và IBA nhạy cảm với nhiệt độ và bị phân hủy trong quá trình hấp tiệt trùng và IAA không ổn định trong môi trường nuôi cấy cho dù nó được lọc qua màng lọc vô trùng. Nồng độ của IAA có thể giảm đi 10 lần trong 4 tuần nuôi cấy ở trong tối nếu không được bổ sung thêm, tốc độ phân hủy của auxin ở ngoài sáng xảy ra nhanh hơn đặc biệt trong môi trường MS. IBA ổn định trong môi trường hơn là IAA, mức độ giảm của IBA thấp. Còn NAA và 2,4 – D không bị biến tính trong môi trường nuôi cấy. Ngoài ra, còn có một số auxin khác nhưng chúng rất ít được sử dụng như: 2,4,5 – T, 4 – CPA, MPCA, NOA, Dicamba, Picloram.

Auxin can thiệp vào nhiều hiện tượng sinh lý, hoạt động của nó tùy thuộc vào nồng độ và tác động bổ trợ của chúng với các chất điều hòa tăng trưởng khác.

Auxin tác động lên sự kéo dài tế bào. Hiệu quả này là sự nối tiếp cho sự gia tăng tính đàn hồi của thành tế bào và cho sự xâm nhập của nước vào bên trong tế bào, sức căng của thành tế bào giảm đi và tế bào tự kéo dài ra.

SVTH: Trần Thị Thu Hiền 22 Auxin thay đổi tính thẩm thấu của màng tế bào, sự thay đổi này thể hiện bằng một sự phóng thích ion H+. Ion này gây ra một hoạt tính acid chịu trách nhiệm làm giảm tính đề kháng của thành tế bào bởi sự hấp thu ion K+.

Auxin tác động lên các quá trình chuyển hóa, đặc biệt nhất là trên sự tổng hợp ARN ribosome.

Auxin kích thích sự phân chia tế bào một cách đặc biệt trong quá trình hình thành mô sẹo và sự hình thành rễ bất định. Auxin cũng ức chế sự phát triển của chồi nách và sự hình thành phôi sinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy mô sẹo.

Tất cả cây trồng đều tổng hợp auxin tùy theo giai đoạn phát triển của chúng. Auxin được tổng hợp ở lá non, trong các chồi đang hoạt động, ở phát hoa, ở các quả còn non và lưu thông từ đỉnh xuống phía dưới với một sự phân cực rõ ràng được nhìn thấy rõ trên các cơ quan thực vật còn non. Nhưng trong quá trình vận chuyển này, chúng bị oxy hóa do hoạt động của các enzyme auxin - oxidase, điều này cho thấy nồng độ auxin luôn cao hơn ở những vùng tổng hợp ra chúng.

Đối với một số loài, auxin cần cho sự hình thành rễ của các cành giâm (Võ Thị Bạch Mai, 2004).

 Cytokinin

Cytokinin là một trong nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật.

Cytokinin ít có ảnh hưởng trên một thực vật nguyên vẹn và nó có hiệu quả trong việc kích thích sự sinh tổng hợp protein.

Cytokinin được phát hiện sau auxin và gibberellin. Người ta biết rằng trong môi trường nuôi cấy, việc bổ sung cytokinin sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự phân chia tế bào và hình thành chồi. Cytokinin là các hợp chất adenin được thay thế, có 2 nhóm cytokinin nội sinh được biết đến là zeatin và IPA, ngoài ra còn có 2 nhóm cytokinin tổng hợp được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô thực vật là Kinetin và BAP. Các loại cytokinin tự nhiên như

SVTH: Trần Thị Thu Hiền 23 zeatin và IPA ít được sử dụng trong các thí nghiệm vì giá thành cao, chỉ thường sử dụng Kinetine và BAP.

Cytokinin tác động hiệu quả lên sự phân chia tế bào khi có sự hiện diện của auxin: auxin tạo điều kiện thuận lợi cho sự nhân đôi DNA và cytokinin cho phép tách rời nhiễm sắc thể.

Trong nuôi cấy mô, nếu lượng cytokinin không đủ thì sự phân chia của nhân tế bào sẽ bị chặn lại tại một giai đoạn trong chu trình tế bào. Khi cấy chuyển mô sang môi trường mới có chứa cytokinin thì tế bào sẽ phân chia liên tục sau giai đoạn nghỉ. Người ta còn cho rằng sự phân chia tế bào trong mô sẹo xảy ra khi không có sự hiện diện của cytokinin trong môi trường nuôi cấy là do tế bào đã tự tổng hợp được cytokinin cho nó

Cytokinin rất có hiệu quả trong vai trò kích thích sự tạo chồi trực tiếp hoặc gián tiếp trên thực vật nguyên vẹn cũng như trên mô thực vật nuôi cấy in vitro. Tác dụng này của cytokinin đôi khi trở nên hiệu quả hơn khi phối hợp với auxin. Một tỉ lệ thích hợp giữa auxin và cytokinin sẽ có hiệu quả trên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy.

Cytokinin cũng có khả năng kích thích sự tăng trưởng của chồi bên và làm giảm hiện tượng ưu tính ngọn trong nuôi cấy chồi của những loài cây lá rộng, người ta thường bổ sung một hoặc vài loại cytokinin vào môi trường nuôi cấy.

Nồng độ cytokinin quá cao sẽ kích thích sự hình thành của nhiều chồi nhỏ nhưng những chồi này không thể kéo dài hoặc làm cho lá bị biến dạng hoặc làm cho chồi chứa nhiều nước.

Để kích thích sự tạo chồi bất định trực tiếp từ mẫu cấy hoặc gián tiếp qua sự tạo mô sẹo thì người ta thường phối hợp cytokinin với auxin.

Cytokinin có vai trò trong sự tạo cơ quan thực vật, chúng kích thích mạnh mẽ sự thành lập chồi non, trái lại ở nồng độ cytokinin cao chúng thường cản hoặc làm chậm sự tạo rễ. Đôi khi người ta cũng nhận thấy rằng cytokinin cũng cảm ứng sự tạo rễ hoặc kích thích sự tăng trưởng của rễ hoặc kích thích sự tạo

SVTH: Trần Thị Thu Hiền 24 thành rễ bất định khi không có sự hiện diện của auxin. Trong hầu hết các trường hợp, chỉ có nồng độ cytokinin thấp là có hiệu quả.

Người ta thường bổ sung cytokinin với nồng độ thấp vào môi trường nuôi cấy để cảm ứng sự tạo mô sẹo có khả năng sinh phôi đặc biệt là những cây lá rộng. Tuy nhiên, cũng có vài bằng chứng cho rằng cytokinin lại cản sự sinh phụi ở cõy một lỏ mầm vớ dụ như: cytokinin ngoại sinh 0.001 àM đủ để ngăn cản sự sinh phôi ở Dactylis glomerata. Cytokinin nội sinh cũng có thể ngăn cản sự tạo phôi ở một số loài thực vật.

Cytokinin kích thích quá trình chuyển hóa, bảo vệ các chất chuyển hóa chống lại tác động của enzyme phân giải, làm chậm quá trình lão hóa. Các chồi nách được xử lý bằng cytokinin sẽ tăng trưởng và cạnh tranh với chồi ngọn.

Ảnh hưởng của cytokinin trên sự nuôi cấy mô và cơ quan phụ thuộc vào loại cytokinin sử dụng, kiểu nuôi cấy, loài thực vật được nuôi cấy và mẫu cấy được thu từ mô còn non hay mô đã trưởng thành.

Trường hợp duy trì mẫu cấy trong điều kiện nhiệt độ cao bất thường thì làm giảm hiệu quả của cytokinin nhưng có thể làm tăng hiệu quả của auxin.

Hầu như sự tăng trưởng chồi không xảy ra ở 30oC.

Tóm lại, cytokinin giúp duy trì sự sống của mô, kích thích sự phân chia tế bào và định hướng tế bào trong con đường phân hóa, tạo điều kiện thuận lợi cho nuôi cấy in vitro.