Chương 4: Kết quả - Thảo luận
4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng tái sinh chồi từ các dòng mô sẹo khác
Mục đích thí nghiệm xem xét khả năng tái sinh chồi từ các dòng mô sẹo thu được ở thí nghiệm 2 từ đó tìm ra được dòng mô sẹo có khả năng cảm ứng lượng chồi nhiều phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo.
Hình thái mô sẹo phụ thuộc rất nhiều vào loại cũng như nồng độ của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật hiện diện trong môi trường nuôi cấy. Qua số thí nghiệm, ghi nhận nếu giữ nguyên nồng độ và loại auxin trong môi trường
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 52 nuôi cấy, nhưng thay đổi thành phần và nồng độ cytokinin thì hình thái của mô sẹo thay đổi (Mehra và Jaidka, 1985; Pal và cộng sự, 1985; Shrikhande và cộng sự, 1993). Ở thí nghiệm 3 lượng auxin giữ nguyên còn lượng cytokinin tăng (auxin/cytokinin = 1:5) thì có sự tạo chồi từ mô sẹo. Những mô sẹo sau khi thành lập sẽ phát sinh chồi do tác động của cytokinin ngoại sinh. Vì vậy, tổng số chồi tạo ra là kết quả của cả hai quá trình phát sinh trực tiếp và gián tiếp. Tuy nhiên, sự hình thành chồi từ mô sẹo không kéo dài do hoạt tính của cytokinin giảm theo thời gian. Do đó, đến một thời điểm nào đó, mặc dù mô sẹo còn nhưng chồi không phát sinh. Lượng auxin nội sinh lúc này sẽ có tác dụng lên quá trình tạo rễ là chủ yếu. Sự dừng phát sinh chồi từ mô sẹo sẽ sớm hơn cũng như số lượng và chiều dài rễ tạo ra sẽ lớn hơn khi sử dụng cytokinin hoạt tính thấp hơn.
Khả năng tái sinh chồi của 2 dòng mô sẹo được ghi nhận và trình bày trong bảng 4.4.
Bảng 4.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của IBA kết hợp với BA hoặc Kinetine lên sự phát sinh chồi từ hai dạng mô sẹo khác nhau
Nghiệm
thức Môi trường Số chồi trung bình
Chiều cao chồi TB (cm) 1 0.1 mg/l IBA +
0.5 mg/l BA 12a(*) 1.24b 2 0.1 mg/l IBA +
0.5 mg/l Kinetine 9b 1.34a
Ghi chú: (*) Trong cùng một cột, các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái không cùng kí tự thì có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thông kê với mức xác suất P = 0,05.
Tuy nhiên, xét về mặt hình thái thì các chồi trong môi trường có chất điều hòa khác nhau cũng rất khác nhau.Trên môi trường có bổ sung IBA và BA, mô sẹo tái sinh chồi, chồi khỏe, có thân màu hồng nhạt, ở ngọn chồi có màu trắng, chồi ra lá tươi, có màu xanh; trên môi trường có bổ sung IBA và
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 53 Kinetin, mô sẹo cũng có khả năng tái sinh chồi nhưng chồi yếu, có màu hồng nhạt, đầu chồi bị đen và chồi chết dần từ ngọn xuống (Hình 4.3).
Cytokinin thuận lợi cho sự phân nhánh của các chồi non của cây thân thảo. Để tăng hệ số nhân giống người ta tăng nồng độ cytokinin trong môi trường nuôi cấy ở giai đoạn tạo chồi in vitro. Nhóm cytokinin đẩy nhanh sự phân chia tế bào, sự nhân chồi và sự phát triển chồi. Các chồi đang tăng trưởng được kích thích mạnh mẽ bởi nồng độ cytokinin. Từ nhiều nghiên cứu, người ta rút ra kết luận vai trò của cytokinin trong nuôi cấy chồi: tăng sinh chồi bên, tạo chồi bất định, cản sự tạo rễ (nồng độ cytokinin cao từ 0.5 – 10 mg/l thường cản hoặc làm chậm sự tạo rễ, đồng thời cũng cản sự tăng trưởng của rễ và cản hiệu quả kích thích tạo rễ của auxin). Cytokinin là một nhóm hormon thực vật đặc biệt đóng vai trò chính trong chu trình tế bào và ảnh hưởng đến nhiều quá trình phát triển. Srinivasan và Mullin phát biểu rằng các cytokinin ngoại sinh hoạt hóa các cytokinin nội sinh đang đi lên trong mạch mộc. Sự thiếu hụt cytokinin ở thực vật sẽ làm xuất hiện các chồi bị lùn, đồng thời các đỉnh sinh trưởng nhỏ lại, ti thể và lạp thể kéo dài ra, sự tạo tế bào mới chỉ còn khoảng 3 – 4% so với bình thường. Ngoài ra, các đỉnh sinh trưởng rễ của các cây này phình to, phát triển nhanh hơn và có nhiều rễ nhánh hơn. Tất cả các hiện tượng trên cho thấy rằng cytokinin là một yếu tố rất quan trọng ở thực vật giúp điều hòa hoạt động và kiểm soát sự phát sinh hình thái của đỉnh sinh trưởng. Qua thí nghiệm điều khiển sự hình thành cơ quan từ đốt thân của cây thuốc lá, Skoog thấy rằng hoạt động của cytokinin có ảnh hưởng đáng kể đến ribonucleic acid (RNA), ông cho rằng cytokinin điều hòa sự hình thành cơ quan thông qua việc ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp các yếu tố sinh trưởng khác như: thiamin, auxin, ngoài ra cytokinin còn đóng vai trò như các chất điều hòa sự sinh tổng hợp protein. Qua đó thấy được một hiện tượng rất phổ biến trong sinh vât, đó là sự xuất hiện của yếu tố này làm thay đổi ngưỡng của yếu tố khác. Ảnh hưởng của cytokinin trên mô, cơ quan nuôi cấy phụ thuộc vào loại cytokinin sử dụng, kiểu nuôi cấy, loài thực vật được nuôi cấy và mẫu
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 54 cấy thu từ mô còn non hay mô đã trưởng thành. BA kích thích sự tăng sinh chồi bên của Castanea, trong khi kinetine không có ảnh hưởng gì cả, kinetine chỉ kích thích sự tạo chồi bên trong quá trình nuôi cấy chồi Prunus và để tăng sinh chồi cần sử dụng đến BA. Qua các kết quả trên cho thấy được vai trò của chất điều hòa sinh trưởng thực vật ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái thực vật là rất đáng kể và rất khác nhau giữa các loài.
Không chỉ có thể tái sinh chồi thông qua mô sẹo mà còn có thể tái sinh chồi trực tiếp từ các cơ quan như: lá, thân, cuống lá, chồi ngủ, đế hoa, lát mỏng tế bào,… Những chồi phát sinh từ những mô trưởng thành không liên quan đến mô phân sinh ngọn gọi là chồi bất định. Về cơ bản, mọi cơ quan thực vật đều có khả năng tái sinh các mô phân sinh ngọn chồi bởi sự sinh cơ quan trực tiếp hay gián tiếp. Ở các cây hạt kín, nguồn gốc của chồi có thể là tế bào biểu bì, mô hàng rào, mô khuyết hay mô bao quanh mạch của mô cấy. Trước khi phân hoá để tạo mới chồi thì mọi tế bào đã phân hoá đều phải được tái hoạt động.
Sự tái hoạt động trong quá trình phát sinh cơ quan cần phải được cảm ứng bằng cách: gỡ hiệu ứng cản tương quan trên cây nguyên, như cắt chồi ngọn để gỡ ưu tính ngọn; hoặc dùng môi trường thích hợp cho mô cấy mô in vitro.
Các thí nghiệm tạo chồi bất định thường cho kết quả cao khi sử dụng cytokinin ở nồng độ cao và auxin từ nồng độ thấp đến trung bình (Gaspar và cs., 2003). Kết quả này đã được ghi nhận trên nhiều đối tượng như Diospyros kati Thunb. (Choi, 2001), cà chua Licopersicon esculentum L. (Chaudary, 2001), hoa loa kèn Zantedeschia albomaculata (Chang, 2003), Crataeva adansonii (dc.) prodr. (Sharma, 2003), khoai tây (Yasmin, 2003).
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 55 Hình 4.3. Chồi được tái sinh từ 2 dòng mô sẹo trên 2 môi trường khác nhau
[1]: Môi trường có bổ sung IBA và BA [2]: Môi trường có bổ sung IBA và Kinetine
Trong sự khởi đầu và điều hoà sự tăng trưởng của cơ quan, chất điều hòa tăng trưởng thực vật có vai trò quan trọng. Khi nuôi cấy trên môi trường có cytokinin và auxin thì sự phát triển chồi được kích thích. Cần có một sự cân bằng về nồng độ của từng loại hormone trong từng loại mô, ở từng vị trí chuyên biệt. Khi tỷ lệ cytokinin/auxin (C/A) cao thì kích thích tạo chồi; ngược lại tỷ lệ C/A thấp thì kích thích tạo rễ (Bùi Trang Việt, 2000) và dựa vào thí nghiệm 2 nên ở thí nghiệm 3 cấy mẫu trên môi trường sử dụng 0.1 mg/l IBA kết hợp với 0.5 mg/l BA hoặc 0.5 mg/l Kinetine. Sự phát sinh chồi ở Torenia cũng tuân theo nguyên tắc về tỉ lệ A/C: A/C cao: kích thích tạo rễ, A/C tiến gần về 1: kích thích tạo mô sẹo, từ những mô sẹo này sau đó hình thành chồi gián tiếp, A/C thấp: kích thích tạo chồi trực tiếp. Tỉ lệ giữa A/C sẽ xác định sự tạo cơ quan: tỉ lệ cao: tạo chồi, tỉ lệ thấp: tạo rễ (Skoog và Tsui, 1948; Miller và Skoog, 1953; Paulet, 1965; Gautheret, 1959). Một nồng độ cytokinin cao phối hợp với auxin nồng độ thấp rất quan trọng trong việc tạo chồi ở nhiều loài thực vật khác nhau như Begonia (Ringe và Nitsch, 1968; Heide, 1965),
1 2
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 56 cây cải ốc biển (horse radish) (Wurm, 1960; Sastri, 1963), cây mao địa hoàng (foxglove) (Dolfus và Nicolas-Prat, 1969), Atropa belladonna (Zenkteler, 1971) và cây bông cải (Margara, 1969).
Ngoài ra, sự tái sinh chồi còn phụ thuộc vào hiện tượng ưu thế ngọn và sự hình thành các mô phân sinh bên để hình thành các chồi bên mới dọc theo trục của chồi chính. Ưu thế ngọn là một hiện tượng do chồi đỉnh ức chế sự phát triển của các chồi bên nằm bên dưới. Trong điều kiện nuôi cấy in vitro, có rất nhiều nhân tố ảnh hưởng đến tăng trưởng và phát triển của chồi, cũng như sự ức chế mối tương quan giữa chồi đỉnh và chồi bên nằm dưới chồi đỉnh. Trong các loại chất điều hoà tăng trưởng, thì auxin và cytokinin được sử dụng để điều hoà hiện tượng ưu tính ngọn. Theo mô hình giải thích cổ điển thì: auxin được tổng hợp tại ngọn, sau đó di chuyển trong libe (hữu cực) và trong tế bào (vô cực) đến cơ quan cuối cùng là rễ. Auxin điều hoà một cách trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua các cơ chế khác bao gồm hoạt hoá các chất điều hoà thứ cấp, điều hoà tỷ lệ A/C. Khi gia tăng hàm lượng cytokinin trong mô thì hiện tượng ưu tính ngọn bị phá vỡ sự bật chồi được kích thích bởi cytokinin; trái ngược với tác động của auxin (Bùi Trang Việt, 2000). Áp dụng vào thí nghiệm này cũng sử dụng auxin (IBA) và cytokinin (BA hoặc Kinetine).
BA là loại cytokinin có hiệu quả cao trong sự cảm ứng tạo chồi ở nhiều loài thực vật. Các loại cytokinin khác (kinetine, 2i – P, PBA và zeatin) cũng có thể được sử dụng nhưng ít hơn BA (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006). Kết quả thí nghiệm 3 cho thấy khi kết hợp IBA và BA thì cho số chồi nhiều, còn sự kết hợp của IBA và Kinetine thì cho số chồi ít nhưng chồi kéo dài thân. Để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo là cần số chồi để tiến hành tiếp nên tiếp tục khảo sát ở dải nồng độ khác nhau của IBA và BA để đưa ra được nồng độ thích hợp nhất cho số chồi nhiều nhất. Hầu hết những bằng chứng về nhu cầu cytokinin đặc biệt đều được thực hiện trong nuôi cấy chồi của nhiều loài thực vật khác nhau. Cytokinin sẽ hoạt hoá sự phân chia tế bào bằng cách kích thích sự tổng hợp mạnh mẽ acid nucleic, protein và các chất
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 57 cần thiết cho quá trình phân chia tế bào với điều kiện có auxin kết hợp.
Cytokinin tác động trên cả hai bước của sự phân chia tế bào: phân nhân và phân bào. Cytokinin giúp sự gia tăng kích thước tế bào và sinh tổng hợp protein, nhưng cytokinin cản sự kéo dài tế bào. Ở giai đoạn gia tăng kích thước tế bào thì auxin có vai trò quan trọng, kích thích mạnh sự kéo dài tế bào diệp tiêu và tế bào vùng kéo dài dưới ngọn. BA kích thích sự tăng sinh chồi bên của Castanea (Vieitez, 1980) trong khi kinetine không có ảnh hưởng gì.
Zeatin có khuynh hướng kích thích sự tăng trưởng của chồi chính và chỉ làm tăng nhẹ sự nảy các chồi bên. Tương tự, 2-iP và kinetine chỉ kích thích sự tạo chồi bên trong quá trình nuôi cấy chồi Prunus; và để tăng sinh chồi cần phải sử dụng đến BA (Martinelli, 1985). Ở thí nghiệm này sự kết hợp của IBA và BA cho ra chồi tốt hơn khi kết hợp giữa IBA và Kinetine.
Quan sát hình thái và số lượng chồi cho thấy ở môi trường có bổ sung IBA và BA cho số lượng chồi nhiều và chồi tươi tốt, còn ở môi trường có bổ sung IBA và Kinetine chồi cao hơn nhưng số lượng chồi ít hơn và chồi có xu hướng chết. Do đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu tiếp trên môi trường có bổ sung IBA và BA để tái sinh chồi ở nhiều nồng độ khác nhau để chọn ra nồng độ cho tỉ lệ chồi cao nhất để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.