Chương 4: Kết quả - Thảo luận
4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của IBA và BA lên khả năng tái sinh
Với mục đích tạo chồi bất định thì sự kết hợp của auxin và cytokinin cho kết quả tốt hơn khi sử dụng một mình cytokinin (Vũ Vaờn Vuù, 1999). Ở thớ nghiệm này sử dụng kết hợp IBA và BA với nồng độ khác nhau để tái sinh chồi từ mô sẹo nhằm thu được lượng chồi nhiều phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo. Các thí nghiệm tạo chồi bất định thường cho kết quả cao khi sử dụng cytokinin ở nồng độ cao và auxin từ nồng độ thấp đến trung bình (Gaspar và cộng sự, 2003), kết quả này được ghi nhận trên nhiều đối tượng như Diospyros kati Thunb (Choi, 2001), cà chua Licopersicon
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 58 esculentum L. (Chaudary, 2001), hoa loa kèn Zantedeschia albomaculata (Chang, 2003), Crataeva adansonii (dc.) prodr (sharma, 2003), khoai tây (Yasmin, 2003).
Kết quả sau 4 tuần nghiên cứu khả năng bật chồi của mô sẹo ở môi trường bổ sung chất kích thích tăng trưởng IBA kết hợp với BA ở nhiều nồng độ khác nhau được trình bày trong bảng bảng 4.5.
Bảng 4.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của IBA kết hợp với BA lên sự phát sinh chồi
Môi trường Số chồi trung bình
C1 3.33b (*)
C2 20.67ab
C3 18b
C4 22.33ab
C5 20.0b
C6 49.33a
C7 24.33ab
C8 22.67ab
Ghi chú: (*) Trong cùng một cột, các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái không cùng kí tự thì có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thông kê với mức xác suất P = 0,05.
Trong hầu hết các trường hợp, sự hình thành chồi, rễ từ mô của những cây còn non dễ hơn là từ những cây trưởng thành. Tuổi mô ảnh hưởng đến cả số lượng chồi hình thành cũng như kích thước của chồi hay cây con. Mô trẻ cho thấy là nguồn mẫu tốt nhất cho vài nghiên cứu. Giai đoạn sinh lý của cây mẹ ảnh hưởng đến sự hình thành chồi trên mô nuôi cấy. Các chất điều hòa kích thích sự hình thành chồi đáng kể và một sự tương tác giữa khả năng tái sinh, tuổi mô và nồng độ chất điều hòa tăng trưởng tối ưu.
Sự tạo chồi và rễ từ mô sẹo đòi hỏi cần phải có sự điều chỉnh lại nồng độ auxin và cytokinin cảm ứng ban đầu. Khi nồng độ cytokinin cao hơn auxin thì sẽ có sự tạo chồi từ mẫu cấy. Ngược lại, khi nồng độ auxin cao hơn cytokinin
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 59 hoặc khi chỉ xử lý với auxin thì rễ sẽ được hình thành. Trong sự tạo rễ thì lượng cytokinin ngoại sinh sẽ là chất cản. Người ta cho rằng auxin cảm ứng sự tạo rễ là do nó cảm ứng sự tổng hợp polyamine (Friedman và cộng sự, 1985). Bởi vậy tỉ lệ giữa auxin và cytokinin ở thí nghiệm 2 và 3 có sự khác biệt rõ ràng để có thể tạo mô sẹo hay tạo chồi hay rễ từ mẫu cấy.
Hình 4.4. Chồi tái sinh trên các môi trường bổ sung IBA và BA ở các nồng độ khác nhau
[1]: Môi trường C1 bổ sung 0.1 mg/l IBA và 0.25 mg/l BA [2]: Môi trường C2 bổ sung 0.1 mg/l IBA và 0.5 mg/l BA [3]: Môi trường C3bổ sung 0.1 mg/l IBA và 0.75 mg/l BA [4]: Môi trường C4 bổ sung 0.1 mg/l IBA và 1.0 mg/l BA [5]: Môi trường C5 bổ sung 0.25 mg/l IBA và 0.5 mg/l BA [6]: Môi trường C6 bổ sung 0.25 mg/l IBA và 0.75 mg/l BA [7]: Môi trường C7 bổ sung 0.25 mg/l IBA và 1.0 mg/l BA [8]: Môi trường C8 bổ sung 0.25 mg/l IBA và 1.25 mg/l BA
Quan sát hình thái và số liệu cho thấy, khi cố định lượng IBA, thay đổi lượng BA tăng thì số chồi tăng đến một mức nhất định thì số chồi lại giảm dần, khi số chồi tăng lên thì chiều cao chồi lại giảm vì số chồi quá nhiều chồi ko thể kéo dài thân ra được. Điều này được chứng minh bởi Nguyễn Đức Lượng và
1 2 3 4
5 6 7 8
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 60 Lê Thị Thủy Tiên (2006), để kích thích sự tăng trưởng của chồi bên và làm giảm hiện tượng ưu tính ngọn trong nuôi cấy chồi của những loài cây lá rộng, người ta thường bổ sung một hoặc vài loại cytokinin vào môi trường nuôi cấy ở giai đoạn II. Cách này có thể cảm ứng được sự tăng trưởng của một vài chồi nhỏ từ mỗi mẫu cấy sau khoảng 4 – 6 tuần. Nồng độ cytokinin quá cao sẽ kích thích sự hình thành của nhiều chồi nhỏ nhưng những chồi này không thể kéo dài. Để kích thích tạo chồi bất định trực tiếp từ mẫu cấy hoặc gián tiếp qua sự tạo mô sẹo thì người ta thường phối hợp cytokinin với auxin (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006).
Ở môi trường có bổ sung 0.25 mg/l IBA kết hợp với 0.75 mg/l BA cho số lượng chồi cao nhất nhưng chiều cao chồi rất thấp vì số lượng chồi quá nhiều.
Từ đó cho thấy chỉ có thể chọn một trong hai yếu tố là số lượng chồi hoặc chiều cao chồi, nếu muốn thu được số lượng chồi nhiều thì không thể có chồi kéo dài thân.
Khi nồng độ cytokinin cao hơn auxin thì sẽ có sự tạo chồi từ mẫu cấy. Ngược lại, khi nồng độ auxin cao hơn hoặc khi xử lý auxin thì rễ sẽ được hình thành.
Trong sự tạo rễ thì lượng cytokinin ngoại sinh là chất cản. Khi phối hợp cùng với auxin thì cytokinin sẽ kích thích sự phân chia tế bào và điều khiển sự phát sinh hình thái. Khi được bổ sung vào trong môi trường nuôi cấy chồi thì những hợp chất này phá vỡ trạng thái hưu miên của chồi non và kích thích sự hoạt động của các chồi bên. Khi không có cytokinin trong môi trường nuôi cấy thì kì giữa của chu trình tế bào sẽ bị kéo dài vì vậy người ta cho rằng cytokinin cần thiết trong sự điều hòa sinh tổng hợp protein tế bào trong sự tăng trưởng và phát triển của tế bào. Cytokinin rất có hiệu quả trong vai trò kích thích sự tạo chồi trực tiếp hoặc gián tiếp trên thực vật nguyên vẹn cũng như mô thực vật nuôi cấy in vitro. Tác dụng này của cytokinin đôi khi trở nên hiệu quả hơn khi phối hợp với auxin. Trong thí nghiệm, việc kết hợp hai loại chất điều hòa là cytokinin và auxin cũng cho kết quả làm tăng số lượng chồi
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 61 hình thành. Đặc biệt là sự kết hợp của IBA và BA cho lượng chồi hình thành khá cao.
Sau khi có được số lượng chồi nhiều, chúng tôi tiến hành tách cụm chồi lớn ra thành từng cụm nhỏ và cấy chuyển sang môi trường MS không bổ sung chất kích thích tăng trưởng để chồi có thể kéo dài thân và ra rễ thành cây con. Từ đây có thể tiến hành các nghiên cứu tiếp theo như cấy chuyển sang môi trường kích thích tượng nụ và ra hoa trong ống nghiệm hoặc tiến hành giai đoạn đưa cây con ra vườn trồng.
Hình 4.5. Cây con hoàn chỉnh có chồi và rễ
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 62