Chương 4: Kết quả - Thảo luận
4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa IBA kết hợp với BA
Tác động của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật được ghi nhận sau 4 tuần nuôi cấy, kết quả thu nhận được trình bày trong bảng 4.2 và 4.3
Bảng 4.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của IBA kết hợp với BA lên sự phát sinh mô sẹo
Môi trường Trọng lượng mô sẹo trung bình (g) 0.1 mg/l IBA + 0.1 mg/l BA 0.4752b (*)
0.25 mg/l IBA + 0.25 mg/l BA 1.0160b
0.5 mg/l IBA + 0.5 mg/l BA 1.6637a
Ghi chú: (*) Trong cùng một cột, các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái không cùng kí tự thì có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thông kê với mức xác suất P = 0,05.
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 47 Bảng 4.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của IBA kết hợp với Kinetine lên sự
phát sinh mô sẹo
Môi trường Trọng lượng mô sẹo trung bình (g) 0.1 mg/l IBA + 0.1 mg/l Kinetine 0.0953b (*)
0.25 mg/l IBA + 0.25 mg/l Kinetine 0.0963b 0.5 mg/l IBA + 0.5 mg/l Kinetine 0.1608a
Ghi chú: (*) Trong cùng một cột, các giá trị trung bình theo sau bởi các chữ cái không cùng kí tự thì có sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thông kê với mức xác suất P = 0,05.
Các mẫu cấy trong môi trường MS không bổ sung chất kích thích tăng trưởng thì mẫu cấy chỉ kéo dài ra sau đó đen dần và chết.
Các loại auxin và cytokinin khác nhau có tương tác khác nhau. Do đó, ảnh hưởng của chúng lên mẫu cấy cũng khác nhau. Trong môi trường MS có bổ sung thêm IBA kết hợp với BA hoặc Kinetine dù ở nồng độ nào thì vẫn hình thành mô sẹo nhưng loại cytokinin khác nhau thì cho loại mô sẹo khác nhau.
Nếu là IBA kết hợp với BA thì hình thành loại mô sẹo đặc, có màu trắng vàng và nâu nhạt, xốp bông, mô sẹo phát triển nhanh. Còn IBA kết hợp với Kinetine thì hình thành loại mô sẹo cứng, có màu nâu đen, ít hoặc ko xốp, mô sẹo phát triển chậm. Điều này cũng được chứng minh bởi Mehra và Jaidka, 1985; Pal và cộng sự, 1985; Shrikhande và cộng sự, 1993). Nếu giữ nguyên nồng độ và loại auxin trong môi trường nuôi cấy, nhưng thay đổi thành phần và nồng độ cytokinin thì hình thái mô sẹo thay đổi. Tốc độ tăng trưởng của mô sẹo phụ thuộc vào thành phần, cũng như nồng độ của auxin (Bonner và Galston, 1959; De Garcia và Martnez, 1995; Grant và Fuller, 1968). Nồng độ auxin tăng cao kích thích tạo mô sẹo dạng bở nhưng khi giảm nồng độ auxin thì mô sẹo có dạng nốt và chắc (Ceriani và cộng sự, 1992).
Auxin có vai trò quan trọng trong sự tạo mô sẹo (Ahloowalia, 1991;
Komamin và cộng sự, 1992; Liu và cộng sự, 1993; Zimmerman, 1993). Trong môi trường nuôi cấy, auxin thường gây ra sự tạo bướu ở các mô và cơ quan, kích thích sự phân chia tế bào (tạo mô sẹo), kích thích sự tạo rễ bất định, gây
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 48 ra sự phát sinh phôi từ tế bào soma từ các huyền phù tế bào (Pierik, 1987).
Khi nồng độ auxin thấp thì sự tạo rễ bất định chiếm ưu thế, khi nồng độ auxin cao sẽ không có sự tạo rễ nhưng lại xảy ra sự tạo mô sẹo (Torres, 1989). Đa số mẫu cấy thực vật thuộc nhóm song tử diệp không có khả năng tạo mô sẹo trong môi trường chỉ có auxin mà cần phải có một sự phối hợp giữa cytokinin và auxin (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006). Đối với cây hoa mười giờ cũng là cây thuộc nhóm song tử diệp nên môi trường nuôi cấy có sự kết hợp giữa auxin và cytokinin là rất cần thiết cho cây để tạo mô sẹo. Điều này cũng được chứng minh bởi Shrikhande và cộng sự, 1993 khi nghiên cứu trên tử diệp cây mầm Azadirachta indica A. cần IAA ở nồng độ 0.5 mg/l và BA 1.0 mg/l để có thể tạo mô sẹo ; lá của Solanum tuberosum L. cần có sự phối hợp giữa 2,4-D 3.0 mg/l, NAA 1.0 mg/l và kinetine 0.2 mg/l cho sự tạo mô sẹo (Nguyễn Đức Thành, 1983). Có một số công trình nghiên cứu của Libbenga và Torrey, 1973 ; Simpson và Torrey,1977 trên mô rễ cây đậu nành, ghi nhận có sự tổng hợp DNA trước khi phân bào thì cần auxin và cytokinin.
Nếu môi trường chỉ có auxin thì hàm lượng DNA được ghi nhận là không thay đổi.
Khi nồng độ auxin tăng thì nhận thấy trọng lượng tươi của mô sẹo cũng tăng lên, do auxin kích thích rất mạnh sự phân chia tế bào tượng tầng nhưng hầu như không tác động trên mô phân sinh sơ cấp, nên auxin tác động lên sự tăng trưởng theo đường kính. Sau một thời gian nuôi cấy, nồng độ auxin nội sinh sẽ từ từ tăng lên (Phan Hoàng Anh, 2000).
Khả năng tạo mô sẹo của mô và cơ quan phụ thuộc rất nhiều vào trạng thái sinh lý, sinh hóa và kiểu gen (Torres, 1989). Sự tăng sinh của mô sẹo là kết quả của sự cân bằng giữa trạng thái sinh lý của mẫu cấy và tác động của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật ngoại sinh áp dụng trong môi trường nuôi cấy (Pal, Banerjee và Dhar, 1985). Do vậy, việc chọn lựa ở cơ quan để tiến hành cấy vô mẫu ban đầu là rất quan trọng, ở thí nghiệm này mẫu cấy được
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 49 chọn là những đốt thân còn non ở cây tươi, khỏe, kết quả thu được sau khi vô mẫu là mô sẹo để tiến hành thí nghiệm 3.
Hình 4.1. Mô sẹo ở môi trường có bổ sung IBA kết hợp với BA
[1]: Môi trường bổ sung 0.1 mg/l IBA và 0.1 mg/l BA [2]: Môi trường bổ sung 0.25 mg/l IBA và 0.25 mg/l BA [3]: Môi trường bổ sung 0.5 mg/l IBA và 0.5 mg/l BA
Hình 4.2. Mô sẹo ở môi trường có bổ sung IBA kết hợp với Kinetine [1]: Môi trường bổ sung 0.1 mg/l IBA và 0.1 mg/l Kinetine
[2]: Môi trường bổ sung 0.25 mg/l IBA và 0.25 mg/l Kinetine [3]: Môi trường bổ sung 0.5 mg/l IBA và 0.5 mg/l Kinetine
Mô sẹo là một đám tế bào không phân hóa, có đặc tính phân chia mạnh, thường được tạo ra do những xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan, nhất là
1 2 3
3 2
1
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 50 trong sự tạo rễ (Bùi Trang Việt, 2000). Các tế bào thuộc các mô hoặc các cơ quan này, trừ các tế bào của mô phân sinh, phải chịu một sự phản phân hóa trước lần phân chia đầu tiên (Halperin, 1969). Sự phản phân hóa có vai trò rất quan trọng, nó cho phép một tế bào đã trưởng thành trở lại trạng thái trẻ (trẻ hóa). Sự trẻ hóa giúp tế bào tái lập khả năng phân chia và tạo phôi soma trong điều kiện thích hợp (Pierik, 1987).Các tế bào thuộc các mô hoặc các cơ quan đã phân hóa của các cây song tử diệp thường phản phân hóa dưới tác động của auxin riêng rẽ hay kết hợp với một cytokinin để cho ra mô sẹo. Mô sẹo được tạo ra ngoài nguyên nhân do các tế bào nhu mô chịu sự phản phân hóa còn do sự phân chia các tế bào tượng tầng, sự xáo trộn trong các mô phân sinh sơ khởi hay sự xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan (Hunault, 1979). Khi đặt trong môi trường, các mẫu cấy sẽ phồng ra, dày lên do sự hấp thu nước, dinh dưỡng và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật. Có rất nhiều mô và cơ quan thực vật có thể được sử dụng để làm vật liệu tạo mô sẹo như: thân, lá, phát hoa, cuống lá, rễ,… (Street, 1969) ; ở thí nghiệm này sử dụng mẫu cấy là đốt thân hoa mười giờ, khi cấy vào môi trường đã bổ sung auxin và cytokinin thì mẫu cấy phồng ra và chỗ phồng đó to dần tạo thành mô sẹo. Điều này cũng được chứng minh bởi Ochatt và Caso (1986) người ta có thể tạo được mô sẹo từ nhiều loại cơ quan khác nhau của một cơ thể thực vật. Tuy nhiên, với mỗi loại mô hay cơ quan thường phải sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật với loại và nồng độ khác nhau tùy theo mức độ nhạy cảm của các tế bào trong mô hay cơ quan đó.
Mô sẹo phát sinh từ gân và cuống còn sót lại trên lá sớm hơn từ phần phiến lá gần như đồng thời với sự phát sinh mô sẹo từ thân và cuống. Điều này có thể hiểu là do gân có kiểu phân chia giống như thân và cuống (Bùi Trang Việt, 2000), mà thân, cuống (với mô vỏ) có xu hướng tạo mô sẹo hơn mô lá (Dương Công Kiên, 2003). Chọn mẫu cấy là đốt thân vì mẫu đốt thân non, có xu hướng tạo mô sẹo hơn mô lá, mô lá hoa mười giờ quá nhỏ nên khó tạo mô sẹo. Cây non (nguyên vẹn hay được cắt đoạn)hay mảnh thân non của cây
SVTH: Trần Thị Thu Hiền 51 trưởng thành dễ cho mô sẹo trong điều kiện nuôi cấy in vitro, dưới tác động của một auxin mạnh được áp dụng riêng rẽ hay phối hợp với cytokinin (Bùi Trang Việt, 2000). Nhờ vậy trong thân non ‘Sorbone’ có thể tồn tại một lượng auxin nội sinh khá cao nên khi môi trường không chứa bất kì chất điều hòa nào, các mẫu cấy vẫn có thể tạo mô sẹo và lên chồi.
Sự phát triển của mô sẹo có thể chia thành 3 giai đoạn: cảm ứng, phân chia tế bào và phân hóa. Ở giai đoạn phân chia, tế bào mô cấy trở về dạng phân sinh hay trạng thái phản phân hóa. Trong giai đoạn thứ ba, mẫu cấy hình thành nhiều loại mô sẹo khác nhau và có thể hình thành đỉnh chồi, rễ sơ khởi hay tiền phôi. Kết quả thí nghiệm cho thấy chất kích thích tăng trưởng ở nồng độ nào cũng đều cảm ứng tạo mô sẹo, nên sử dụng môi trường nuôi cấy là 0.1 mg/l IBA kết hợp với 0.1 mg/l BA hoặc 0.1 mg/l Kinetine vì ở môi trường này vẫn hình thành mô sẹo mà lại tiết kiệm được lượng chất kích thích điều hòa tăng trưởng thực vật. Theo Skoog, tỉ lệ A/C gần một đơn vị sẽ thu được sinh tạo mô sẹo. Sự phát sinh chồi ở Torenia cũng tuân theo nguyên tắc về tỉ lệ A/C: A/C cao sẽ kích thích tạo rễ, A/C tiến gần về 1 sẽ kích thích tạo mô sẹo, từ những mô sẹo này sau đó hình thành chồi gián tiếp, A/C thấp sẽ kích thích tạo chồi trực tiếp. Tỉ lệ giữa A/C xác định sự tạo cơ quan, tỉ lệ cao tạo chồi, tỉ lệ thấp tạo rễ (Skoog và Tsui, 1948; Miller và Skoog, 1953; Paulet, 1965; Gautheret, 1959).