Chín mươi sáu mẫu vật gồm đất chuyên lúa, mía, tre, phân trùn và ruột trùn được thu thập tại 5 tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long gồm (Cà Mau, Sóc Trăng, Hậu Giang, Cần Thơ và Trà Vinh) dùng để phân lập vi khuẩn phân giải Si. Đối với phân trùn và trùn đất được thu tại các khu vực đất cát. Thông tin về địa điểm và số lượng mẫu thu thập được trình bày trong Bảng 3.1. Quy tắc về việc ký hiệu mẫu phân lập như sau: một hoặc hai ký tự đầu tiên là chữ viết tắt cho tên loại cây trồng canh tác trên nền đất thu mẫu, trong khi hai ký từ sau cùng là chữ viết tắt của tên tỉnh ở đó mẫu được thu thập.
Bảng 3.1: Địa điểm và số lượng mẫu vật được thu thập
STT Địa điểm
Nguồn mẫu vật thu thập
Ký hiệu
Tổng số lượng mẫu (96)
1 Xã Tân Lộc – Huyện Thới Bình – Tỉnh Cà Mau
Đất mía MCM 8
Đất lúa LCM 8
Đất tre TCM 8
2 Xã Hòa An – Huyện Phụng Hiệp – Tỉnh Hậu Giang
Đất mía MHG 8
Đất lúa LHG 8
Đất tre THG 8
3 Xã Thới Thạnh – Huyện Thới Lai – Thành phố Cần Thơ
Đất lúa LCT 8
Đất tre TCT 8
4 Xã Vĩnh Hải – Huyện Vĩnh Châu – Tỉnh Sóc Trăng
Phân Trùn PTST 8
Ruột Trùn RTST 8
5 Xã Ngọc Biên – Huyện Trà Cú – Tỉnh Trà Vinh
Phân Trùn PTTV 8
Ruột Trùn RTTV 8
28 3.2.2 Các trang thiết bị hóa chất
3.2.2.1 Dụng cụ
Dụng cụ sử dụng cho đề tài gồm: bình tam giác, chai trung tính schott duran, cốc thủy tinh, ống đong, bình định mức, micropipette ở các thể tích khác nhau, ống nghiệm, đĩa petri, lame, lamelle, đèn cồn, đũa thủy tinh, kim cấy, eppendorf, các loại đầu pipette…
3.2.2.2 Thiết bị
Thiết bị sử dụng cho đề tài gồm: tủ cấy vô trùng (ESCO, Hoa Kỳ), nồi khử trùng nhiệt ướt (Hirayama, Hoa kỳ), tủ sấy (Memmer, Đức), tủ ủ (Memmer, Đức), cân điện tử (Mettle Toler, Thụy Sĩ), kính hiển vi (Olympus, Nhật Bản), tủ lạnh (Sharp, Nhật Bản), máy đo quang phổ (Thermo Scientific Multiskan Spectrum, Hoa Kỳ), máy ly tâm (Mikro 220R, Đức), máy lắc (GFL 3017 và GFL 3018, Thụy Sĩ), máy PCR (Perkin Elmer 9700, Hoa Kỳ), máy chụp hình gel (BIORAD UV 2000, Hoa Kỳ), máy HPLC (Shimadzu, Nhật Bản), máy đo quang phổ hấp thu nguyên tử iCE 3500 (Thermo Scientific, Hoa Kỳ),...
3.2.2.3 Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong đề tài nghiên cứu được trình bày ở Bảng 3.2.
Bảng 3.2: Danh sách tên và nguồn gốc các hóa chất được sử dụng
STT Hóa chất Xuất xứ
1 (NH4)2SO4 Đức
2 1-amino-2-naptho-4-sulfonic acid Đức
3 Acid tartaric ((CH(OH)COOH)2) Trung Quốc
4 Agar Việt Nam
5 AlPO4 Đức
6 Amonium molypdate ((NH4)6Mo7O24) Hoa Kỳ
7 Ca3(PO4)2 Đức
8 CH3COOH Trung Quốc
9 CH3COONH4 Đức
10 CuSO4.5H2O Trung Quốc
11 EDTA sodium Đức
12 Ethanol 96o Trung Quốc
13 FeCl3 Trung Quốc
14 FePO4 Đức
15 FeSO4.7H2O Trung Quốc
16 Glucose Đức
17 Green master mix 2X Hoa Kỳ
18 H2MoO4.H2O Đức
19 H2O2 Trung Quốc
29
20 H2SO4 Trung Quốc
21 H3BO3 Đức
22 HCl Trung Quốc
23 K2HPO4 Trung Quốc
24 K2Sb2(C4H2O6)2 Đức
25 K2SO4 Đức
26 KCl Trung Quốc
27 KOH Đức
28 Ladder Hoa Kỳ
29 L-ascorbic acid Ấn Độ
30 Loading dye Hoa Kỳ
31 L-Tryptophan Ấn Độ
32 Mg2O8Si3 Đức
33 MgSO4.7H2O Đức
34 MnCl.4H2O Đức
35 Mồi 1492R Hoa Kỳ
36 Mồi 27F Hoa Kỳ
37 Na2CO3 Trung Quốc
38 Na2HPO4.12H2O Trung Quốc
39 Na2SO3 Trung Quốc
40 NaCl Trung Quốc
41 NaClO Trung Quốc
42 NaH2PO4.2H2O Trung Quốc
43 NaHSO3 Nhật
44 NaOH Đức
45 NH4NO3 Trung Quốc
46 Si chuẩn Thụy Sĩ
47 Sodium nitroprusside dehydrate Đức
48 Sodium salicylate Phần Lan
49 Trisodium citrate dehydrate Đức 50 Tryptone Soya Broth (TSB) Ấn Độ
51 ZnSO4.7H2O Trung Quốc
3.2.3 Các môi trường được sử dụng trong đề tài
3.2.3.1 Sodium phosphate buffer (Martelli and Russo, 1984)
- NaH2PO4.2H2O 31,2 g
- Na2HPO4.12H2O 39,3 g
- Nước khử khoáng 1,0 L
3.2.3.2 Dung dịch đất (soil extract) (Bold, 1949)
- Đất 40 g
30
- Nước khử khoáng 50 mL
3.2.3.3 Môi trường dung dịch đất agar (Vasanthi et al., 2013)
- Glucose 1,0 g
- K2HPO4 0,5 g
- Dung dịch đất 100 mL
- Agar 20 g
- Nước khử khoáng 900 mL
- Mg2O8Si3 2,5 g
- pH 7,0 – 7,2
3.2.3.4 Môi trường dung dịch đất lỏng (Vasanthi et al., 2013)
- Glucose 1 g
- K2HPO4 0,5 g
- Dung dịch đất 100 mL
- Nước khử khoáng 900 mL
- Mg2O8Si3 2,5 g
- pH 7,0 – 7,2
3.2.3.5 Môi trường TSA (ATCC, 2012)
- Tryptone Soya Broth (TSB) 30 g
- Agar 15 g
- Nước khử khoáng 1,0 L
3.2.3.6 Gel agarose (Didenko, 2006)
- Agarose 2,0 g
- TAE 0,5X 100 mL
- Safeview 4,0 àL
3.2.3.7 Dung dịch thủy canh Hoagland (Hoagland and Arnon, 1938)
- KNO3 0,606 g
- Ca(NO3)2.4H2O 0,944 g
- KH2PO4 0,136 g
- MgSO4.7H2O 0,492 g
- (NH4)2SO4 0,132 g
- KCl 0,447 g
- Mg2O8Si3 2,500 g
- Dung dịch Fe (thành phần dung dịch Fe trong 1 lít gồm: EDTA sodium 26,1 g, KOH 19 g và FeSO4.7H2O 24,9 g)
0,25 mL - Dung dịch khoáng vi lượng (trong 1 lít
bao gồm: H3BO3 2,86 g, MnCl.4H2O 1,81 g; ZnSO4.7H2O 0,22 g, CuSO4.5H2O 0,08 g và H2MoO4.H2O 0,02 g)
1,0 mL
31
- Nước khử khoáng 1,0 L
3.2.3.8 Dung dịch khử (Patnaik, 2017)
- Dung dịch (1) chứa 2,0 g Na2SO3 và 0,4 g 1-amino-2-naptho-4-sulfonic acid dùng nước khử khoáng lên thể tích dung dịch trong bình định mức 25 mL.
- Dung dịch (2) chứa 25 g NaHSO3 thêm nước khử khoáng để lên thể tích dung dịch trong bình định mức 100 mL.
Trộn dung dịch (1) và (2) với nhau, sau đó định mức đến thể tích 250 mL bằng nước khử khoáng, cuối cùng, bảo quản trong chai nhựa cho sử dụng.
3.2.3.9 Dung dịch vô cơ mẫu cho hiện màu đạm
1 g CuSO4 và 10 g K2SO4 trong 100 mL nước khử khoáng.
3.2.3.10 Dung dịch hiện màu đạm
- Dung dịch A: 0,05 g sodium nitroprusside dehydrate, 13 g sodium salicylate và 10 g trisodium citrate dehydrate định mức lên 100 mL bằng nước khử khoáng.
- Dung dịch B: 6 g NaOH định mức lên 100 mL, sau đó thêm 2 mL NaClO.
3.2.3.11 Hóa chất kiểm tra IAA (Thuốc thử R2 (Salkowski), Glickmann and Dessaux, 1995)
1 L dung dịch H2SO4 10,8 M và 4,5 g FeCl3. 3.2.3.12 Dung dịch xác định lân tổng số
- Dung dịch A: 12 g (NH4)6Mo7O24.4H2O hòa tan trong 250 mL nước khử khoáng; 0,2098 g K2Sb2(C4H2O6)2 hòa tan trong 100 mL nước khử khoáng và 140 mL H2SO4.
- Dung dịch B: 1,056 g L-ascorbic acid và 200 mL dung dịch A.