3.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.3.3 Nội dung nghiên cứu 3: Khảo sát khả năng cố định đạm, hòa
3.3.3.1 Khả năng cố định đạm
* Mục tiêu:
Nghiên cứu được tiến hành nhằm mục tiêu khảo sát khả năng cố định đạm của 5 dòng vi khuẩn phân giải Si tuyển chọn trong môi trường Burk lỏng (Park et al., 2005).
* Chuẩn bị nguồn vi khuẩn: Tham khảo mục 3.3.1.4.
STT Thành phần Thể tớch (àL) Nồng độ sau cựng
1 Green master mix 2X 25,0 1X
2 27F primer (10 àmol) 1,0 0,2 àmol
3 1492R primer (10 àmol) 1,0 0,2 àmol
4 DNA 1,0 <250 ng
5 DW (Nước khử khoáng) 22,0
36
* Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được thực hiện trong bình tam giác 50 mL với 3 lần lặp lại tương ứng với 3 bình tam giác, lặp lại tất cả các nghiệm thức cho 6 ngày bố trí thí nghiệm. Nghiệm thức đối chứng được thực hiện tương tự nhưng không chủng vi khuẩn và cách thực hiện như sau: hút 0,5mL dịch vi khuẩn đã chuẩn bị sẵn cho vào bình tam giác 50mL chứa 15mL môi trường Burk đã tiệt trùng. Mẫu được lắc trên máy lắc tròn với tốc độ 100 vòng/phút ở điều kiện phòng thí nghiệm và trong tối. Mỗi nghiệm thức có tổng cộng 18 lặp lại tương ứng với 18 bình tam giác và ở mỗi thời điểm thu mẫu, 3 lặp lại của từng nghiệm thức tương ứng với 3 bình tam giác được đem đi phân tích hàm lượng N cố định bởi vi khuẩn.
* Chỉ tiêu theo dõi:
Hàm lượng đạm hữu dụng trong môi trường nuôi cấy được cố định bởi vi khuẩn và mật số vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy vào các thời điểm: 0, 1, 2, 3, 4 và 5 ngày bố trí thí nghiệm.
- Phương pháp xác định hàm lượng đạm hữu dụng trong môi trường nuôi cấy:
(1) Vô cơ mẫu: ở mỗi thời điểm thu mẫu, 3 bình tam giác ở mỗi nghiệm thức được vô cơ. Quy trình vô cơ mẫu như sau: hút 5 mL H2SO4 đậm đặc vào bình tam giác chứa mẫu, lắc nhẹ, thêm 1,5 mL dung dịch vô cơ CuSO4, để nguội, sau đó, mẫu được đun trên bếp đến khi dung dịch mẫu chuyển thành màu đen đậm. Tiếp theo, bình tam giác chứa mẫu được để nguội, sau đó nhỏ vài giọt H2O2 30%, đun đến khi dung dịch mẫu chuyển sang màu trắng. Cuối cùng, dung dịch mẫu được định mức lên 50 mL, để mẫu sau 24 giờ và tiến hành hiện màu.
(2) Quy trình hiện màu: hút 0,5mL dung dịch được định mức vào ống nghiệm 30 mL. Tiếp theo, thêm 1 mL nước khử khoáng, 0,5 mL NaOH (3,6 M), 0,5mL dung dịch A và 0,5 mL dung dịch B. Vortex mẫu ở mỗi bước, sau đó để yên ở nhiệt độ phòng 30 phút, cuối cùng đo quang phổ ở bước sóng 650 nm.
- Phương pháp xác định mật số vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy:
mật số vi khuẩn được xác định theo phương pháp nhỏ giọt (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2008) thực hiện như sau: dịch nuôi vi khuẩn được pha loãng với hệ số 10 và vortex đều. Hút 50 L dịch vi khuẩn ở các nồng độ pha loãng 10-
2, 10-4, 10-6 nhỏ 5 giọt lên trên bề mặt môi trường TSA. Sau đó, mẫu được ủ ở 30oC, sau 24 giờ tiến hành đếm số khuẩn lạc hiện diện trên bề mặt đĩa môi trường và xác định mật số vi khuẩn/mL (CFU.mL-1).
3.3.3.2 Khả năng hòa tan 3 dạng lân khó tan
* Mục tiêu:
Nghiên cứu được thực hiện nhằm mục tiêu khảo sát khả năng hòa tan ba nguồn lân khó tan khác nhau gồm Ca3(PO4)2, FePO4 và AlPO4 của 5 dòng vi
37
khuẩn phân giải Si tuyển chọn trong môi trường NBRIP lỏng (Mehata and Nautiyal, 2001).
* Chuẩn bị nguồn vi khuẩn: Tham khảo mục 3.3.1.4.
* Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 3 nghiệm thức với 3 lần lặp lại cho mỗi nghiệm thức. Nghiệm thức đối chứng không bổ sung vi khuẩn được thực hiện tương ứng với nghiệm thức bổ sung nguồn lân khác nhau. Thí nghiệm được kéo dài trong 10 ngày và cách thực hiện như sau: hút 1 mL dịch vi khuẩn đã chuẩn bị sẵn cho vào bình tam giác 100 mL có chứa 29 mL môi trường NBRIP lỏng đã tiệt trùng bổ sung riêng lẻ ba nguồn lân khó tan khác nhau gồm Ca3(PO4)2, FePO4 và AlPO4. pH môi trường được hiệu chỉnh về pH 7.
Các bình tam giác chứa mẫu được lắc trên máy lắc tròn với tốc độ 100 vòng/phút ở nhiệt độ phòng thí nghiệm và trong tối.
* Các chỉ tiêu theo dõi:
Hàm lượng lân hòa tan và mật số vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy vào các thời điểm: 0, 2, 4, 6, 8 và 10 ngày nuôi cấy.
- Cách xác định hàm lượng lân hòa tan trong môi trường nuôi cấy như sau: hút 2 mL dịch mẫu môi trường nuôi cấy vi khuẩn tại thời điểm thu mẫu, ly tâm ở tốc độ 14.000 vòng/phút trong 5 phút. Dung dịch mẫu sau khi ly tâm được pha loãng với nước khử khoáng, sau đó hút 5 mL dịch pha loãng cho vào ống nghiệm. Các ống nghiệm được tiếp tục cho thêm 1 mL dung dịch B (Tỷ lệ mẫu và dung dịch B là 5:1) (dung dịch A: 12 g (NH4)6Mo7O24.4H2O hòa tan trong 250 mL nước khử khoáng; 0,2098 g K2Sb2(C4H2O6)2 hòa tan trong 100 mL nước khử khoáng và 140 mL H2SO4; dung dịch B: 1,056 g L-ascorbic acid và 200 mL dung dịch A), vortex đều mẫu trong 1 phút. Sau đó, để ổn định 30 phút ở nhiệt độ phòng. Cuối cùng, tiến hành đo mẫu trên máy so màu ở bước sóng 880 nm.
- Phương pháp xác định mật số vi khuẩn: tham khảo mục 3.3.3.1.
3.3.3.3 Khả năng tổng hợp hormone thực vật indole-3-acetic acid (IAA)
* Mục tiêu:
Nghiên cứu được thực hiện nhằm mục tiêu khảo sát khả năng tổng hợp hormone thực vật IAA của 5 dòng vi khuẩn phân giải Si tuyển chọn trong môi trường NBRIP (Glickmann and Dessaux, 1995; Nghia et al., 2017).
* Chuẩn bị nguồn vi khuẩn: Tham khảo mục 3.3.1.4.
* Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí trong bình tam giác 100 mL với 3 lần lặp lại tương ứng với 3 bình tam giác và cách thực hiện như sau: hút 1 mL dịch vi khuẩn đã chuẩn bị sẵn cho vào bình tam giác chứa 29 mL môi trường NBRIP lỏng chứa 100 mg.L-1 tryptophan. Các bình tam giác chứa mẫu được đặt trên máy lắc tròn
38
với tốc độ 100 vòng/phút ở điều kiện phòng thí nghiệm và trong tối. Thí nghiệm được kéo dài trong 12 ngày.
* Chỉ tiêu theo dõi:
Hàm lượng IAA được tổng hợp và mật số vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy vào các thời điểm 0, 2, 4, 6, 8, 10 và 12 ngày nuôi cấy.
- Cách xác định hàm lượng IAA như sau: hút 1,5 mL dịch vi khuẩn trong ống nghiệm cho vào eppendorf 2 mL. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút.
Sau đó, hút 1 mL phần dịch trong sau khi ly tâm cho vào các ống nghiệm đã chứa sẵn 2 mL thuốc thử R2 (thành phần 1 l thuốc thử R2: 1 l H2SO4 10,8 M và 4,5 g FeCl3), vortex giúp trộn đều dung dịch, để yên ở nhiệt độ phòng 10 phút trong điều kiện tối để tạo phản ứng tạo màu xảy ra. Cuối cùng, đo quang phổ ở bước sóng 530 nm.
- Phương pháp xác định mật số vi khuẩn: tham khảo mục 3.3.3.1.
3.3.3.4 Khả năng tổng hợp acid acetic, acid lactic và acid citric
* Mục tiêu:
Nghiên cứu được thực hiện nhằm mục tiêu khảo sát khả năng tổng hợp acid acetic, acid lactic và acid citric cho quá trình phân giải khoáng Si của 5 dòng vi khuẩn phân giải Si tuyển chọn trong môi trường lỏng có bổ sung 0,25%
magnesium trisilicate.
* Chuẩn bị nguồn vi khuẩn: Tham khảo mục 3.3.1.4.
* Bố trí thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí trong ống nghiệm có thể tích 30 mL. Mỗi dòng vi khuẩn thử nghiệm được thực hiện với 3 lần lặp lại tương ứng với 3 ống nghiệm và cách thực hiện như sau: hút 0,5 mL dung dịch vi khuẩn đã dược chuẩn bị sẵn ở trên cho vào ống nghiệm chứa 4,5 mL môi trường dung dịch đất lỏng (Vasanthi et al., 2013) bổ sung 0,25% magnesium trisilicate. Mẫu được lắc liên tục trên máy lắc ngang với tốc độ 100 vòng/phút và trong tối. Thí nghiệm được kéo dài trong 10 ngày.
* Chỉ tiêu theo dõi:
Hàm lượng các acid hữu cơ do vi khuẩn tiết ra như acid acetic, acid gluconic và acid lactic trong môi trường nuôi cấy lỏng vào các thời điểm 2, 4 và 6 ngày nuôi cấy. Phương pháp phân tích acid hữu cơ như sau: mẫu được ly trích và thu mẫu dung dịch từ các nghiệm thức thí nghiệm để xác định hàm lượng của các acid hữu cơ do vi khuẩn tiết ra như acid acetic, acid gluconic và acid lactic theo phương pháp đo trên máy HPLC (High Performance Liquid Chromatography) (Liu et al., 2006; Saiyad et al., 2015). Cách thực hiện như sau: lấy 1,5 mL dung dịch mẫu từ các nghiệm thức thí nghiệm cho vào eppendorf 2 mL, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút, tiếp theo, lấy 1 mL dịch trong sau ly tâm cho vào vial 1,5 mL. Sau đó, thực hiện đo mẫu trên hệ thống HPLC sử dụng cột C18, pha động
39
H3PO4 0,1% (hiệu chỉnh pH=2,7), bước sóng 210 nm, tốc độ dòng chảy của pha động là 0,5 mL/phút và thể tích hút mẫu là 10 μL.