L ỜI NÓI ĐẦU
3.2.Nhân đoạn gen mã hóa16S rRNAvà trình tự ITS2 của các mẫu ốc cối bằng kỹ thuật
cối bằng kỹ thuật PCR
Đoạn gen mã hóa 16S rRNA và đoạn chèn ITS2 của các loài ốc cối được
khuếch đại sử dụng hai cặp mồi tham khảo 16S (Espiritu và cs, 2001) và ITS2 (Nam và cs, 2009), tương ứng. Trước hết, các thành phần và điều kiện của phản ứng PCR được khảo sát để tìm ra điều kiện tối ưu cho việc nhân các đoạn trình tự này.
Khảo sát các thành phần phản ứng
Nồng độ Mg2+ (được cung cấp dưới dạng MgCl2), các dNTP, mồi và enzyme ảnh hưởng lớn tới chất lượng của phản ứng PCR. Nồng độ Mg2+ quá thấp làm giảm hoạt tính enzyme Taq polymerase, trong khi nồng độ mồi và các dNTP quá cao có thể dẫn tới lỗi bắt cặp và làm giảm tính đặc hiệu của sản phẩm. Qua khảo sát, chúng tôi đã tìm ra được các nồng độ thành phần tối ưu cho việc khuếch đại cả 2 đoạn trình tự nói trên như sau:
Thành phần Nồng độ cuối Thể tích (µl)
DNA 100 ng 2
H2O loại ion - 33,8
MgCl2 25 mM 2 mM 4
dNTP 10 mM (4 loại) 0,25 nM mỗi loại 1 Mồi xuôi 10 pM 0,2 pM 2,5 Mồi ngược 10 pM 0,2 pM 2,5 Taq buffer 10X (MgCl2) 1X 5 Taq polymerase 5 u/ml 1u 0,2
Tổng 50
Khảo sát chu trình nhiệt tối ưu
Dựa trên thông số về nhiệt độ nóng chảy của các mồi trên lý thuyết (bảng
Bảng 3.2: Các thông số của mồi STT Tên primer Size (bp) MW (g/mole) Thành phần GC (%) Nhiệt độ nóng chảy - Tm (0C) 1 16SF 22 6695,4 54,5 58,60C 16SR 21 6389,2 38,0 50,50C 2 ITS-3D 19 5870,9 52,6 54,20C ITS-4R 20 5999,9 40,0 51,50C
Chu trình nhiệt cho cặp mồi 16S:
1) 94oC trong 3 phút, 35 chu kỳ của (94oC trong 40 giây, 48oC trong 40 giây, 72oC trong 1 phút 30 giây), 72oC trong 5 phút.
2) 94oC trong 3 phút, 35 chu kỳ của (94oC trong 40 giây, 50oC trong 40 giây, 72oC trong 1 phút 30 giây), 72oC trong 5 phút.
3) 94oC trong 3 phút, 35 chu kỳ của (94oC trong 40 giây, 52oC trong 40 giây, 72oC trong 1 phút 30 giây), 72oC trong 5 phút.
Chu trình nhiệt cho cặp mồi ITS2:
1) 98oC trong 3 phút, 34 chu kỳ của (98oC trong 10 giây, 50oC trong 30 giây, 72oC trong 30 giây), 72oC trong 5 phút
2) 98oC trong 3 phút, 34 chu kỳ của (98oC trong 10 giây, 52oC trong 30 giây, 72oC trong 30 giây), 72oC trong 5 phút
3) 98oC trong 3 phút, 34 chu kỳ của (98oC trong 10 giây, 55oC trong 30 giây, 72oC trong 30 giây), 72oC trong 5 phút
Kết quả khảo sát cho nhiệt độ bắt cặp của mồi cho thấy, đối với cặp mồi
16S, chu trình nhiệt 1 cho kết quả tốt nhất. Còn đối với cặp mồi ITS2, chu trình nhiệt 3 cho kết quả tốt nhất. Sản phẩm PCR thu được ở cả hai quy trình đều là một band đậm nét, có kích thước vào khoảng 550 bp (đối với đoạn gen 16S
rDNA, hình 3.3A) và 650 bp (đối với đoạn trình tự ITS2, hình 3.3B) phù hợp với
tính toán lý thuyết.
Hình 3.3: Ảnh điện di sản phẩm PCR của các loài ốc cối. Sản phẩm PCR của 7 mẫu ốc cối tượng trưng được điện di trên gel agarose 1,5%. Kết quả được ghi nhận bằng hệ thống ghi ảnh gel tự động Gel-Doc và phần mềm Quantity One (hình 3.3A: sản phẩm PCR đoạn gen mã hóa 16S rRNA; hình 3.3B: sản phẩm PCR đoạn trình tự ITS2). Giếng 1: Conus textile; Giếng 2:
Conus striatus; Giếng 3: Conus vexillum; Giếng 4:Conuscapitaneus; Giếng 5: Conus miles; Giếng 6: Conus litteratus; Giếng 7: Conus caracteristicus.
Sử dụng các chu trình nhiệt này chúng tôi đã nhân được đoạn gen mã hóa 16S rRNA và trình tự ITS2 của 13 ốc cối. Danh sách các mẫu ốc đã nhân gen
được trình bày trong bảng 3.2.
Sản phẩm PCR của các mẫu ốc cối tiếp tục được tinh sạch và gửi đi giải
trình tự gen trực tiếp. Các kết quả giải trình tự đầu tiên đối với sản phẩm PCR đoạn gen 16S rDNA một lần nữa khẳng định chúng tôi đã nhân đặc hiệu được
đoạn gen này. Hơn thế nữa thông tin về trình tự các loài ốc cối cũng hoàn toàn phù hợp với kết quả phân loạiốc cối bằng hình thái trước đó. Do điều kiện thời
gian có hạn, kết quả phân tích trình tự các đoạn gen 16S rDNA không được trình bày ở đây. Trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA của các mẫu ốc cối đã giải trình tự được đăng ký trên ngân hàng gen quốc tế Genebank có các mã số như sau:
Bảng 3.3: Danh sách các loài ốc cối đã nhân gen
STT Tên loài Điều kiện bảo quản
1 Conus textile -400C 2 Conus striatus -400C 3 Conus vexillum -400C 4 Conus capitaneus -400C 5 Conus miles -400C 6 Conus litteratus -400C 7 Conus caracteristicus -400C 8 Conus distans -400C 9 Conus quercinus -400C 10 Conus magus -400C 11 Conus arenatus -400C 12 Conus tessulatus -400C 13 Conus marmoreus -400C
Bảng 3.4: Danh sách các loài ốc cối đã giải trình tự đoạn gen 16S rDNA
STT Tên loài Mã số 1 Conus arenatus HM212491 2 Conus capitaneus HM212492 3 Conus caracteristicus HM212493 4 Conus distans HM212494 5 Conus litteratus HM212495 6 Conus magus HM212496
7 Conus quercinus HM212497
8 Conus striatus HM212498
9 Conus tessulatus HM212499
10 Conus textile HM212500
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN
KẾT LUẬN
Từ các kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi đưa ra một số kết luận như sau:
1. Đã khảo sát được vị trí lấy mẫu mô tách chiết DNA thích hợp (vị trí mô cơ ở
phần nón).
2. Đã tách chiết được DNA tổng số của 13 loài ốc cối Việt Nam thu thập được
tại hai khu vực Đảo Lý Sơn (Quảng Ngãi) và Cù Lao Chàm (Quảng Nam):
Conus textile, Conus striatus, Conus vexillum, Conus capitaneus, Conus miles, Conus litteratus, Conus caracteristicus, Conus distans, Conus quercinus, Conus magus, Conus arenatus, Conus tessulatus, Conus marmoreus.
3. Đã tìm ra được chu trình nhiệt tối ưu và nhân đặc hiệu được đoạn gen mã hóa 16S rRNAvà đoạn trình tự ITS2 của 13 loài ốc cối nói trên.
Chu trình nhiệt nhân đoạn gen mã hóa 16S rRNA sử dụng cặp mồi
16S:
94oC trong 3 phút, 35 chu kỳ của (94oC trong 40giây, 48oC trong 40 giây, 72oC trong 1 phút 30 giây), 72oC trong 5 phút.
Chu trình nhiệt nhân đoạn trình tự ITS2 sử dụng cặp mồi ITS2:
98oC trong 3 phút, 34 chu kỳ của (98oC trong 10 giây, 55oC trong 30 giây, 72oC trong 30 giây), 72oC trong 5 phút.
ĐỀ XUẤT Ý KIẾN
1. Khảo sát thêm một số phương pháp lưu giữ mẫu và nguồn gen lâu dài
khác như bảo quản mẫu mô trong ethanol 95% hoặc acetone 80% và bảo quản mẫu DNA tinh sạch trong đệm TE 1X.
2. Tiếp tục tiến hành tách chiết DNA và nhân gen đối với các mẫu ốc mới
thu được cũng như mở rộng địa điểm thu mẫu.
3. Đối với các mẫu đã nhân gen, tiếp tục gửi đi giải trình tự và tiến hành phân tích trình tự cũng như xây dựng cây phát sinh chủng loại loài.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Azam L, Dowell C, Watkins M, Stitzel JA, Olivera BM, McIntosh JM. Alpha-conotoxin BuIA, a novel peptide from Conus bullatus, distinguishes among neuronal nicotinic acetylcholine receptors. J Biol Chem (2005) 280: 80-87.
2. Ainzilber M, Kofman O, Zlotkin E, Gordon D. A new neurotoxin receptor site on sodium channels is identified by a conotoxin that affects sodium channel inactivation in molluscs and acts as an antagonist in rat brain. J Biol Chem (1994) 269: 2574-2580.
3. Bandyopadhyay PK, Stevenson BJ, Cady MT, Olivera BM, Wolstenholme DR. Complete mitochondrial DNA sequence of a Conoidean gastropod, Lophiotoma (Xenuroturris) cerithiformis: gene order and gastropod phylogeny. Toxicon (2006) 48:29-43.
4. Bandyopadhyay PK, Stevenson BJ, Ownby JP, Cady MT, Watkins M, Olivera BM. The mitochondrial genome of Conus textile, coxI-coxII intergenic sequences and Conoidean evolution. Mol Phylogenet Evol (2008) 46:215-223.
5. Becker S, Terlau H. Toxins from cone snails: properties, applications and biotechnological production. Appl Microbiol Biotechnol (2008) 79: 1-9. 6. Chivian E, Roberts CM, Bernstein AS. The threat to cone snails. Science
(2003) 302: 391.
7. Duda TF, Kohn AJ, Palumbi Sr. origins of diverse feeding ecologies within Conus, a genus of venomous marine gastropods. Biological Journal of the Linnean Society (2001), 73: 391–409.
8. Duda TF, Jr., Rolan E. Explosive radiation of Cape Verde Conus, a marine species flock. Mol Ecol (2005) 14:267-272.
9. Duda TF, Jr., Bolin MB, Meyer CP, Kohn AJ. Hidden diversity in a hyperdiverse gastropod genus: discovery of previously unidentified members of a Conus species complex. Mol Phylogenet Evol (2008) 49:867-876.
10.Espiritu DJ, Watkins M, Dia-Monje V, Cartier GE, Cruz LJ, Olivera BM. Venomous cone snails: molecular phylogeny and the generation of toxin diversity. Toxicon (2001) 39:1899-1916.
11.Epstein PR, Chivian E, Frith K. Emerging diseases threaten conservation. Environ Health Perspect (2003) 111: A506-507.
12.Grande C, Templado J, Zardoya R. Evolution of gastropod mitochondrial genome arrangements. BMC Evol Biol (2008) 8:61.
13.Hillyard DR, Olivera BM, Woodward S, Corpuz GP, Gray WR, Ramilo CA, et al. A molluscivorous Conus toxin: conserved frameworks in conotoxins. Biochemistry (1989) 28: 358-361.
14.Hillyard DR, et al. A new Conus peptide ligand for mammalian presynaptic Ca2+ channels. Neuron (1992) 9:69-77.
15.Terlau H, Olivera BM. Conus venoms: a rich source of novel ion channel- targeted peptides. Physiol Rev (2004) 84:41-68.
16.Stewart J, Gilly WF. Piscivorous behavior of a temperate cone snail, Conus californicus. Biol Bull (2005) 209:146-153.
17.Kaas Q, Westermann JC, Halai R, Wang CK, Craik DJ. ConoServer, a database for conopeptide sequences and structures. Bioinformatics (2008) 24: 445-446.
18.Marshall J, Kelley WP, Rubakhin SS, Bingham JP, Sweedler JV, Gilly WF. Anatomical correlates of venom production in Conus californicus. Biol Bull (2002) 203: 27-41.
19.Nam HH, Corneli PS, Watkins M, Olivera B, Bandyopadhyay P. Multiple genes elucidate the evolution of venomous snail-hunting Conus species. Mol Phylogenet Evol (2009) 53:645-652.
20.Nguyễn Ngọc Thạch. Recently collected shells of Viet Nam.L’ Informatore piceno & N.N.T (2007): 7-8 & 24-142.
21.Nguyễn Anh Tuấn. Kết quả khảo sát và thu mẫu ốc cối tại 4 tỉnh Nam Trung
Bộ (2009).
22.Olivera BM, et al. Neuronal calcium channel antagonists. Discrimination between calcium channel subtypes using omega-conotoxin from Conus magus venom. Biochemistry (1987) 26:2086-2090.
23.Olivera BM. Conus peptides: biodiversity-based discovery and exogenomics. J Biol Chem (2006) 281: 31173-31177.
24.Ramilo CA, Zafaralla GC, Nadasdi L, Hammerland LG, Yoshikami D, Gray WR, et al. Novel alpha- and omega-conotoxins from Conus striatus venom. Biochemistry (1992) 31: 9919-9926.
25.Wang CZ, Chi CW.. Conus peptides--a rich pharmaceutical treasure. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai) (2004) 36: 713-723.
26.http://www.conidae.info/
27.http://biology.burke.washington.edu/conus/ 28.http://www.ZipcodeZoo.com