L ỜI NÓI ĐẦU
2.2.1.Tách chiết DNA tổng số
a) Tách chiết DNA tổng số với bộ kít của Công ty Nam Khoa
Các bước tiến hành:
Lấy một mảnh mẫu nhỏ tương đương hạt mè, hay một phần tư hạt gạo
cho vào một ống Eppendorf 1,5ml.
Thêm vào 180µl đệm TE 1X.
Bổ sung20µl dung dịch PROKPREP.
Trộn đều và ủ ở 600C qua đêm.
Sau khi ủ xong, vortex mạnh để mẫu mô nát ra hết, bổ sung 200µl đệm TE 1X cho đủ 400µl.
Thêm 400µl dung dịch P/C/I, vortex mạnh trong 10 giây, ly tâm 13000
vòng trong 2 phút.
Thu phần dịch nổi vào một ống Eppendorf 1,5ml mới.
Bổ sung 40µl (1/10 thể tích) dung dịch Natri acetate 3M, pH 5,2.
Trộn đều bằng cách vortex nhẹ hay búng nhẹ ngón tay lên thành ống
nhiều lần.
Thêm 1ml (2,5 thể tích) ethanol 100% đã để lạnh trong đá rồi trộn đều.
Tủa DNA ở -200C qua đêm.
Ly tâm 13000 vòng trong 10 phút, loại bỏ dịch nổi.
Rửa cặn DNA với 500µl ethanol 70%.
Ly tâm 13000 vòng trong 10 phút, hút bỏ đệm rửa, và làm khô cặn
trong tủ hút chân không ở nhiệt độ phòng.
Hòa tan cặn DNA trong 100µl đệm TE 1X và bảo quản ở -200C.
b) Tách chiết DNA với bộ kít Wizard® SV Genomic DNA Purification System
Các bước tiến hành:
Cắt một mảnh nhỏ chừng khoảng 0,2 cm2 mẫu mô cơ, rửa sạch bằng
nước cất rồi cho vào các ống Eppendorf 1,5ml đã khử trùng.
Sau đó thêm vào 275µl dung dịch phá tế bào (Digestion Solution Master Mix) vào mỗi ống.
Ủ ống mẫu qua đêm trên các block nhiệt ở 550C.
Thêm 250µl dung dịch đệm (Wizard SV Lysis Buffer) vào mỗi ống,
sau đó đem vortex nhẹ.
Hút phần dịch nổi ở mỗi ống sang các cột Wizard SV Minicolumn (được đặt trên các ống thu mẫu 1.5ml).
Ly tâm 13000 vòng trong 3 phút.
Chuyển các cột Wizard SV Minicolumn sang các ống thu mẫu 1,5 ml mới
Thêm vào 650µl dung dịch rửa (Wizard SV Wash Solution).
Ly tâm 13000 vòng 2 phút, loại bỏ phần dung dịch rửa thu được.
Lặp lại bước rửa này thêm 1 lần nữa.
Chuyển cột Wizard SV minicolumn sang một Eppendorf 1,5 ml mới, sau đó thêm vào 50µl nước sạch nuclease và ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 phút.
Dịch chứa DNA hòa tan được thu nhận bằng ly tâm ở 13000 vòng trong 1 phút.
Thêm tiếp 50µl nước sạch nuclease và lặp lại bước trên thêm 1 lần nữa.
Cột Wizard SV Minicolumn được loại bỏ. Dịch chiết DNA được bảo quản ở - 400C cho đến khi sử dụng.