L ỜI NÓI ĐẦU
2.2.2.Nhân gen bằng kỹ thuật PCR
Phản ứng chuỗi nhờ polymerase (Polymerase Chain Reaction) do Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 nhằm khuếch đại một đoạn DNA đích
thành hàng tỷ bản sao để sau đó có thể phát hiện được nhờ vào sự sao chép của
enzyme DNA polymerase chịu nhiệt. Ðể thực hiện được việc khuếch đại, phản ứng PCR dựa vào những chu kỳ nhiệt, mà mỗi chu kỳ được chia làm 3 bước, mỗi bước kéo dài khoảng vài chục giây đến vài phút, tuần tự được thể hiện như hình 2.1.
Hình 2.1: Chu kỳ nhiệt của phảnứng PCR
(http://www.takara-bio.us/)
Giai đoạn biến tính: Nhiệt độ được tăng lên 94-96°C, làm phá vỡ các liên kết hydrogen để tách hai sợi DNA ra. Giai đoạn này kéo dài 1-2 phút.
Giai đoạn gắn mồi: Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp
xuống nhiệt độ bắp cặp của mồi, vào khoảng 45-600C, để mồi có thể gắn vào sợi DNA đơn. Giai đoạn này kéo dài từ 1-2 phút.
Giai đoạn tổng hợp: nhiệt độ được tăng lên 720C, enzyme DNA polymerase hoạt động, kéo dài sợi DNA mới.
Sau 30 đến 35 chu kỳ khi nồng độ DNA được khuếch đại tối đa nhất, lượng dNTP cũng như chất lượng của enzyme DNA polymerase, mồi bị giảm rõ rệt, phản ứng khuếch đại được kết thúc.
Các cặp mồi được chọn để nhân đoạn gen mã hóa 16S rRNA (hệ gen ty thể) (Espiritu và cs, 2001) và đoạn chèn ITS2 (Internal Transcribed Spacer 2) (hệ
a) Nhân đoạn gen mã hóa16S rRNA
Cặp mồi 16S:
16SF-5′-CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T-3′
16SR-5′-GTT TAC CAA AAA CAT GGC TTC-3′ Thành phần phản ứng: Thành phần Thể tích (µl) DNA 2 dH2O 32,8 MgCl2 25mM 4 dNTP 10µM (4 loại) 1 Mồi 16SF 10mM 2,5 Mồi 16SR10mM 2,5 Taq buffer 10X (MgCl2) 5 Taq polymerase 5u/ml 0,2
Tổng 50
Chu trình nhiệt: 94oC trong 3 phút, 35 chu kỳ của (94oC trong 40giây, 48oC trong 40 giây, 72oC trong 1 phút 30 giây), 72oC trong 5 phút, giữ ở
4oC.
b) Nhân đoạn trình tự ITS2
Cặp mồi ITS2
ITS-3D-5´-GCA TCG ATG AAG AAC GCA G-3´ ITS-4R-5´-AGT TTC TTT TCC TCC GCT TA-3´
Thành phần Thể tích(µl) DNA 2 dH2O 32,8 MgCl2 25mM 4 dNTP 10µM (4 loại) 1 Mồi ITS2-3D 10mM 2,5 Mồi ITS2-4R 10mM 2,5 Taq buffer 10X (MgCl2) 5 Taq polymerase 5u/ml 0,2
Tổng 50
Chu trình nhiệt: 98oC trong 3 phút, 34 chu kỳ của (98oC trong 10 giây, 55oC trong 30 giây, 72oC trong 30 giây), 72oC trong 5 phút, giữ ở 4oC.
Sản phẩm PCR được bảo quản ở -20oC.