CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.8. HIỂU BIẾT VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN
DNA là cơ sở hóa học của gen. Phân tử DNA là một chuỗi xoắn kép của hai mạch đơn được cấu tạo từ 4 loại nucleotide khác nhau nhờ các base của chúng, đó là:
A (adenine), C (cytosine), G (guanine) và T (thymine). Các nucleotide này nối kết liên tiếp với nhau theo một thứ tự xác định. Giải trình tự của gen tức là phát hiện được thứ tự sắp xếp của 4 loại nucleotide này trên phân tử DNA.
Các phương pháp giải trình tự gen
Các mạch DNA đơn có đầu bị đánh dấu 32P
1.8.1. Phương pháp hóa học giải trình tự DNA
Vào năm 1977, Maxam và Gilbert đã phát minh được một phương pháp hóa học để có thể giải trình tự một đoạn DNA. Nguyên tắc của phương pháp này là:
- Trước hết là phải đánh dấu một đầu của đoạn DNA cần phải giải trình tự bằng một gốc phospho đồng vị phóng xạ (32P);
- Xử lý các đoạn DNA đã đánh dấu này với chất hóa học có thể làm biến đổi đặc hiệu một hoặc hai loại base của nucleotide trên đoạn DNA. Các nucleotide bị biến đổi này sẽ bị lấy ra khỏi mạch khung đường-phosphate (sugar-phosphate backbone) của đoạn DNA và nhờ đó tách ra được các đoạn mạch đơn có một đầu đánh dấu 32P và một đầu bị mất phân tử base vì phân tử này đã bị lấy ra khỏi mạch khung .
- Thực hiện điện di mẫu DNA đã xử lý trong 4 ống nghiệm này trên 4 hàng của một gel polyacrylamide biến tính để các mạch đơn trong mẫu di chuyển trong gel không bị biến đổi trong quá trình điện di. Nhờ đó, sau khi hoàn tất điện di, các mạch đơn sẽ bị dừng tại các vị trí khác nhau, tùy thuộc vào mạch đơn này dài ngắn khác nhau, theo hàng dọc suốt chiều dài của gel. Áp gel đã điện di này trên một phim nhạy tia X, các vị trí dừng lại của các mạch đơn trên gel điện di sẽ tạo thành các vạch trên phim vì các vị trí này đều bị đánh dấu phóng xạ do các mạch đơn đều có một đầu được đánh dấu bằng 32P. Từ các vạch trên phim xạ ký tự ghi này (autoradiography), có thể đọc được trình tự của các nucleotide của đoạn DNA .
Phương pháp hóa học xác định trình tự DNA của Maxam và Gilbert trên thực tế không phải dễ thực hiện vì cần phải xác định khá nhiều thông số tối ưu cho thí nghiệm, trong đó khó nhất là phải xác định được nồng độ giới hạn nhất của các chất hóa học sao cho khi xử lý mẫu DNA thì trên mỗi đoạn DNA chỉ có một base bị biến đổi để ứng với mỗi vị trí của base bị biến đổi thì sẽ có một mạch đơn có đầu đánh dấu
32P được tách ra. Chính vì sự phức tạp này, phương pháp Maxam Gilbert hiện nay ít được sử dụng, mà thay vào đó các nhà khoa học dùng phương pháp enzyme với nhiều ưu điểm vượt trội hơn.
Hình 1.9. Các mạch đơn có một đầu đánh dấu với 32P và một đầu base Guanine bị lấy khỏi mạch khung do bị biến đổi
CGTAAGG*C*C*A*C*G*T*AdT CGTAAGG*C*C*AdC
CGTAAGG*C*C*A*C*G*TdA
thêm d*NTP, DNA polymer- thêm
d*NTP, DNA polymer- thêm
d*NTP, DNA polymer- thêm
d*NTP, DNA polymer-
CCTTACG GGAATGC CATACGTGG
CCTTAC G
điện di trên gel
Chiều điện di CATACGTGG
1.8.2. Phương pháp enzyme giải trình tự DNA
Phương pháp enzyme được Sanger và các cộng sự phát minh cũng vào năm 1977, và hiện nay phương pháp này càng ngày càng được hoàn thiện và thực hiện dễ
Hình 1.10. Phương pháp Enzyme giải trình tự DNA
Trước hết chèn các đoạn DNA cần phải xác định trình tự vào một vector là phage hay plasmid tại một vị trí mà trình tự chuỗi của vị trí này đã được xác định rõ.
Chuyển thể tức là đưa các vector mang đoạn chèn DNA này vào tế bào vi khuẩn để nhân bản các vector này thành nhiều bản sao, sau đó tách chiết và tinh khiết các vector từ vi khuẩn để thành các vector tự do.
Dùng các đoạn mồi bổ sung một cách đặc hiệu với trình tự của vector tại vị trí chèn đoạn DNA. Thêm vào ống phản ứng men DNA polymerase và 4 loại nucleotide tự do (gọi là dNTP: deoxynucleotide triphosphate) và một lượng rất giới hạn các nu- cleotide tận (terminator, là ddNTP: dideoxynucleotide triphosphate, cũng như dNTP, có 4 loại ddNTP tương ứng với 4 base A, T, C và G). Phản ứng được thực hiện trong 4 ống, và mỗi ống cho một loại ddNTP khác nhau. Bắt đầu từ đoạn mồi, men DNA pol- ymerase sẽ kéo các dNTP vào để tổng hợp mạch đơn bổ sung với mạch DNA chèn trên vector, và sự tổng hợp mạch đơn sẽ bị dừng lại tại vị trí mà ddNTP được kéo vào thay vì dNTP. Lý do sự tổng hợp bị dừng lại là vì ddNTP có cấu trúc hóa học bị mất đi gốc OH tại vị trí carbon thứ 3 của đường deoxyribose, mà gốc OH tại vị trí này chính là nơi để dNTP kế tiếp được gắn vào. Nhờ vậy trong ống phản ứng có các mạch đơn DNA có các chiều dài khác nhau tương ứng với các vị trí trình tự các nucleotide trên đoạn DNA gốc .
Để giải trình tự, người ta dùng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide biến tính. Với phương pháp đánh dấu mồi hay các dNTP bằng đồng vị phóng xạ 32P hay 35S thì sau khi điện di, cũng giống như phương pháp của Maxam và Gilbert, người ta phát hiện các vạch điện di bằng kỹ thuật xạ ký tự ghi, và từ các vạch này giải được trình tự của đoạn DNA
1.8.3. Giải trình tự bằng máy tự động (automated sequencer)
Các phòng thí nghiệm hiện nay đều dùng phản ứng giải trình tự bằng phương pháp enzyme, nhưng khi làm giải trình tự thì thường dùng các máy tự động chứ không dùng kỹ thuật xạ ký tự ghi như trước đây. Để thực hiện được giải trình tự bằng máy tự động thì các mạch DNA đơn sản sinh trong ống phản ứng giải trình tự phải được đánh dấu huỳnh quang để các vạch điện di của các mạch đơn này phát sáng khi đi qua một chùm tia sáng laser. Cấu tạo của một máy tự động giải trình tự gồm hai phần chính yếu, đó là: phần điện di với gel polyacrylamide và phần phát hiện các vạch điện di.
Màu 1 Màu 2 Màu 3 Màu 4
Mắt cảm quang
`
Hình 1.11: Sơ đồ khối một máy tự động giải trình tư dùng bản gel polyacrylamide Phần điện di polyacrylamide có thể là một bản gel hay là một ống mao quản chứa gel. Phần phát hiện vạch điện di là những con mắt cảm quang và một chùm tia laser đi qua trước nó. Nguyên tắc hoạt động của máy là trong suốt quá trình điện di, mỗi khi có một vạch điện di đi qua chùm tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng lên và sự phát sáng này sẽ được con mắt cảm quang ghi nhận và lưu lại thành một đỉnh cường độ sáng trong biểu đồ. Từ biểu đồ của các đỉnh cường độ sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng với các màu để cuối cùng phân tích thành trình tự của đoạn DNA.
Với các máy thế hệ mới sau này, người ta có thể dùng 4 màu huỳnh quang khác nhau để đánh dấu 4 loại ddNTP, nhờ vậy phản ứng giải trình tự có thể thực hiện được chỉ trong một ống nghiệm vàmkhi giải trình tự chỉ cần điện di trên một hàng mà không cần phải trên 4 hàng khác nhau như trước đây. Nếu dùng diện di mao quản thì tùy thuộc vào số mao quản có thể chạy một lần mà người làm thí nghiệm có thể có số mẫu cho mỗi lần chạy nhiều hay ít.
Các thế hệ máy về sau ngày càng có những chương trình đi kèm để chẳng những có thể hiển thị tự động các ký tự hoá học của trình tự DNA mà còn giúp các nhà nghiên cứu có thể: (1) Phát hiện các chi tiết cần thiết trên trình tự như mã khởi đầu, mã kết thúc, vùng đọc mở (ORF: Open Reading Frame), trình tự đặc hiệu cho các enzyme
cắt giới hạn (restriction enzyme), các dấu ấn di truyền...mà các chi tiết này rất cần thiết để lập bản đồ gen...(2) Phiên dịch trình tự trong vùng đọc mở (tức là vùng trình tự có ý nghĩa) thành trình tự acid amin của một protein, nhờ đó có thể xác định, phỏng đoán, hay làm cơ sở ban đầu để hiểu được chức năng của gen...(3) Tự động so sánh trình tự DNA trong thí nghiệm hay một trình tự DNA nạp vào máy, hay có thể trình tự acid amin của protein, với các trình tự khác đã có trong ngân hàng dữ liệu để phát hiện được sự tương đồng với trình tự đã biết, nhờ đó làm cơ sở để xác định gen và chức năng gen...