CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.5. KẾT QUẢ GIẢI MÃ GEN H5 TRÊN ĐÀN GIA CẦM TẠI HUYỆN BỐ TRẠCH
Bằng các phương pháp sinh học phân tử, bao gồm RT-PCR, tách dòng, giải trình tự và phân tích chuỗi gen, chúng tôi thu nhận được toàn bộ chuỗi gen H5 của chủng A/Dk/Vietnam/QuangBinh/BT1113/2017(H5N6) có độ dài 1704 nucleotide và đăng ký Ngân hàng gen với mã số: LC376799. Với mỗi mẫu chúng tôi đã thực hiện giải trình tự 4 lần: 2 lần thực hiện tinh sạch với prime Forward và 2 lần với prime Re- verse. Kết quả sẽ được xử lý bằng phần mềm Bioedit để xác định được một trình tự chính xác hơn (trình tự nucleotide và amino acid của chuỗi gen H5 chủng A/Dk/Vietnam/QuangBinh/BT1113/2017(H5N6) cụ thể tại phụ lục). Kết quả giải trình thể hiện qua giản đồ trình tự tự động tại hình 3.4.
Hình 3.2: Giản đồ giải trình tự tựđộng đoạn Gen H5 của chủng LC376799 (BT13) Qua giản đồ giải trình (hình 3.2) ta thấy, đoạn đầu và đoạn cuối của giản đồ, đồ thị của trình tự phân bố không đều, điểm thu về khá thấp, các đoạn ở giữa khoảng từ cao, đồ thị đẹp và không có độ nhiễu, như vậy cho thấy độ tin cậy của kết quả khá cao.
Chúng tôi truy cập vào ngân hàng gen (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) và thu thập chuỗi gen H5 của các chủng cường độc đương nhiễm thuộc các vùng miền khác nhau của Việt Nam và một số nước Đông Nam Á bằng chương trình Blast. Kết quả thể hiện tại hình 3.3.
Hình 3.3: Đánh giá điểm sequence gen HA chủng LC376799 (BT13) bằng Blast Qua hình 3.3 chúng ta có thể nhận thấy điểm sequence của chủng được phân lập được tại Bố Trạch có điểm cao nhât (nhận dạng dể nhất), hiển thị màu đỏ tương ứng mức điểm >200. Chứng tỏ gen HA thu nhận được chính xác là gen H5 của virus cúm A phân type H5N6. Như vậy có thể khẳng định kết quả của quá trình tách dòng đã lưu giữ được gen H5 của chủng A/Dk/Vietnam/QuangBinh/BT1113/2017(H5N6) và có cơ sở để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo.
3.5.2. Đặc tính amino acid của hemaglutinin (HA) của chủng phân lập tại huyện Bố Trạch.
Bảng 3.9: Đặc tính amino acid của hemaglutinin (HA) của chủng phân lập được tại Bố Trạch năm 2017
Tên virus Connecting pep- tide
HA (numbering)
110 158 160 224 226 228 318
A/duck/Vietnam/QuangBinh
/BT1113/2017(H5N6) RERRRKR/GLF H N T N Q G T Qua bảng 3.9 ta có thể thấy trình tự phân cắt của chủng phân lập được có chưá các chuỗi aminoacid RERRRKR/GLF taị các vùng phân cắt trong phân tử HA, thuộc chủng virus cúm gia cầm thể độc lực cao. (Motiff cleavage site hpai H5 RERRRKR/GLF ,OIE, 2018)
3.5.3. So sánh mức độ tương đồng về thành phần nucleotide của gen H5 giữa chủng A/Dk/Vietnam/QuangBinh/BT1113/2017(H5N6) với các chủng A/H5N6 của Việt Nam, Trung Quốc và Đông Nam Á
Để so sánh tỷ lệ đồng nhất (%) về thành phần nucleotide trong chuỗi gen H5 của chủng virus cúm phân lập tại huyện Bố Trạch với các chủng đã phân lập tại Việt Nam và một số nước Châu Á đã được công bố, chúng tôi thu thập từ ngân
hàng gen (GenBank), sau đó sử dụng chương trình BLAST.
(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)Kết quả thể hiện ở bảng 3.10.
Bảng 3.10. Danh sách các chủng virus cúm A sử dụng để so sánh gen H5
TT Ký hiệu chủng so sánh Loài
mắc Subtype Năm phân lập
Nguồn gốc
Số đăng ký trong ngân hàng
gen
Tỷ lệ (%
đồng nhất nucleotide)
1
A/Dk/Vietnam/QuangBinh/
BT1113
Vịt H5N6 2017 Bố Trạch-
Quảng Bình LC376799 -
2 A/ck/Dongguan/2690/
2013- H5N6
Gà H5N6 2013 Trung Quốc KT762446 99
3 A/feline/Guangdong/1/
2015(H5N6)
Chim
cút H5N6 2015 Trung Quốc GQ149235 91
4
A/dk/Vietnam/LBM758/
2014(H5N6) Vịt H5N6 2014 Việt Nam LC028331 98
5 A/dk/Nha
Trang/75c131/2014(H5N6) Vịt H5N6 2014 Nha Trang LC050627 92
6 A/dk/Quangngai/1037/
2011(H5N1)
Vịt H5N1 2011 Quảng Ngãi JQ898146 89
7 A/dk/Vietnam/OIE-
2533/2011 Vịt H5N1 2011 Việt Nam AB700631 90 Qua kết quả bảng 3.10 cho thấy khi so sánh chủng phân lập tại huyện Bố Trạch với các chủng virus cúm đã phân lập tại Việt Nam và một số nước Châu Á mức độ tương đồng từ 89-99%. Trong đó, chủng A/Dk/Vietnam/QuangBinh/BT1113 liên quan di truyền chặt chẽ với virus A/ck/Dongguan/2690/2013-H5N6 và A/duck/Vietnam/
LBM758/2014(H5N6) với 99% và nhận dạng 98% ở cấp độ nucleotide tương ứng, cho thấy rằng chúng có thể cùng nguồn gốc tiến hóa, kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Bích Nga (2006).