Phương pháp Realtime RT-PCR

CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.7. Phương pháp Realtime RT-PCR

* Nguyên liệu dùng cho phương pháp Realtime RT-PCR xác định lượng virus CGC.

- Khuôn RNA là đoạn cần nhân bản.

- Nước cất vô trùng (Rnase-free).

- RNA đối chứng dương tính M, H5 của virus cúm A/H5N1, A/H5N6.

- Hai đoạn mồi oligonucleotit (primer) và probe (mẫu dò).

- Enzym DNA polymerase chịu nhiệt.

- Các nucleotit tự do: dATP, dGTP, dCTP, dTTP.

- Dung dịch đệm, Mg2+...

* Các bước tiến hành phản ứng Realtime RT-PCR

- Xử lý mẫu dùng cho chiết tách RNA tổng số

+ Vortex ống mẫu (15-30s), bỏ tăm bông, để mẫu lắng cặn khoảng 30 phút ở nhiệt độ phòng.

+ Hút pha nước phía trên sang ống eppendorf mới có đánh ký hiệu mẫu.

+ Bảo quản 40C trong thời gian ngăn (48h). Nếu lưu mẫu thời gian dài thì để ở âm 700C.

- Chiết tách RNA bằng kit QIAamp Viral RNR Mini

+ Cho 560l dung môi AVL vào ống 1,5ml. Cho tiếp 5,6l dung môi carrier RNA.

+ Cho tiếp 140l dung dịch mẫu. Sau đó vortex trong 15 giây.

+ Ủ ở nhiệt độ phòng (15-200C) trong 10 phút, sau đó ly tâm nhanh.

+ Cho vào 560l Ethanol (96-100%). Vortex trong 15 giây, sau đó ly tâm nhanh.

+ Chuyển 630l hỗn dịch vào cột lọc với ống thu (collection tube). Ly tâm trong 1 phút ở 6,000g (8000rpm) ở nhiệt độ phòng. Chuyển cột lọc qua ống thu mới.

+ Cho 500l dung môi AW1 vào cột lọc. Ly tâm 1 phút ở 6,000g (8,000rpm) ở nhiệt độ phòng. Chuyển cột lọc vào ống 1,5ml mới.

+ Cho 60l dung môi AVE vào cột lọc. Ủ 1 phút ở nhiệt độ phòng.

+ Ly tâm 1 phút ở 6,000g (8,000rpm). Bảo quản dung dịch RNA ở âm 200C trong thời gian ngắn (1-2 ngày), ở âm 700C trong thời gian dài.

- Chuẩn bị hỗn hợp nhân gen (master mix)

Quá trình chuẩn bị master mix được tiến hành trong buồng vô trùng. Chuẩn bị ống eppendorf, tiến hành vortex và spin các ống nguyên liệu sau đó lần lượt cho vào ống eppendorf các thành phần với lượng như sau (bảng 2.4)

Bảng 2.4. Thành phần của master mix

TT Nguyờn liệu Lượng (àl)

1 DW 4,3

2 2X ReactionBuffer 7,5

PPP

Primer forward (40uM)

0,9 Primer reverse (40uM)

Probe (10uM)

3 Enzyme mix 0,3

Tổng 13

Sau khi cho các chất trên vào ống eppendorf tiến hành vortex và spin trong thời gian 10 - 15 giây.

- Thực hiện phản ứng

Trước khi tiến hành các phản ứng cần chuẩn bị một số ống eppendorf 0,2 ml tương ứng với số lượng mẫu cần chẩn đoán. Sau đó tiến hành các bước sau:

1) Cho 13àl hỗn hợp master mix vào cỏc tube 0,2 ml.

2) Cho 2àl nước free RNase vào hỗn hợp master mix của tube đối chứng õm.

3) Cho 2àl RNA mẫu đó chiết tỏch được ở trờn vào hỗn hợp master mix của cỏc tube mẫu.

4) Cho 2àl mẫu đối chứng dương vào hỗn hợp master mix của tube đối chứng dương.

Khi thực hiện phải tuân thủ theo trình tự trên, sau mỗi lần cho mẫu vào phải tiến hành đậy nắp ống phản ứng để tránh tạp nhiễm. Phải sử dụng đúng loại pipet để cho mẫu vào phản ứng theo quy định.

Cho toàn bộ các ống phản ứng vào spin down để khỏi dính vào thành ống rồi chuyển sang phòng chạy PCR.

- Chạy trên máy Realtime PCR

Trước khi cài đặt, vận hành máy cần đặt các tube phản ứng vào giếng (well) của máy. Khởi động màn hình máy tính và kích biểu tượng Biorad để tiến hành cài đặt máy. Khai báo vị trí mẫu, cài đặt màu cho probe và cài đặt chu trình nhiệt. Sau khi khai báo xong thì bắt đầu chạy máy.

Invitrogen One-step RT-PCR Kít thực hiện phản ứng RT-PCR theo chu trình luân nhiệt trên máy Biorad như sau (bảng 2.5).

Bảng 2.5. Chu trình luân nhiệt của phản ứng RT-PCR

Quá trình Nhiệt độ Thời gian Chu kỳ

RT 500C 15phút

1

950C 2 phút

PCR 950C 10 giây

40 600C 40 giây

- Đọc kết quả

Sau khi kết thúc phản ứng RT-PCR, nếu trong mẫu dịch có virus cúm A/H5N1;

A/H5N6; A/H7N9 trình tự nucleotit của các gen M, H5, H7 và N1, N6, N9 sẽ được khuếch đại đặc hiệu thông qua những đoạn mồi chuyên biệt. Việc xác định sự có mặt của virus thông qua phần mềm tạo đường cong và chu kỳ ngưỡng (Ct). Kết quả xét nghiệm từng chỉ tiêu căn cứ vào giá trị Ct:

+ Đối chứng dương tính cho giá trị Ct dao động trong khoảng ±2 so với giá trị Ct đã biết.

+ Đối chứng âm tính không có giá trị Ct.

+ Mẫu dương tính khi đường cong khuyếch đại tương tự như đường cong đối chứng dương và giá trị Ct ≤ 35.

+ Kết quả được xem là âm tính, khi không có sự khuếch đại đặc hiệu, đường cong khuếch đại giống như đối chứng âm tính và không cho giá trị Ct.

+ Mẫu được xác định là nghi ngờ khi đường cong khuếch đại giống đối chứng dương nhưng giá trị ngưỡng Ct >35.